乳酸乳球菌电转化方法的优化

．－——３４．－——　江苏农业科学２０１３年第４１卷第８期　于建宁，宋小敬，王公金，等．乳酸乳球菌电转化方法的优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（８）：３４—３６　乳酸乳球菌电转化方法的优化　于建宁　，宋小敬　，王公金　，潘伟芹　，徐小波　，于峰祥　，李　燕　（１．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京２１００１４；２．山东省荣成市畜牧兽医局，山东荣成２６４３００；　３．南京师范大学医学分子生物学重点实验室，江苏南京２１００９７）　摘要：乳酸菌转化效率不高是制约其广泛应用的关键因素。为建立乳酸乳球菌的高效电转化方法，主要从电压、　电阻、细菌生长时期及电击缓冲液等影响电转化的因素入手，根据每微克ＤＮＡ获得的转化子的多少，评价乳酸乳球菌　的电转化效率。结果显示：当电压为２．０　ｋＶ、电阻为４００　Ｑ、细菌处于对数生长中期、电击缓冲液为磷酸缓冲液时，电　击乳酸乳球菌ＭＧ１３６３的转化效率最高，为１　３００个／　ｇ。表明通过优化电转化参数，可以提高乳酸乳球菌的转化效　率，为拓展乳酸乳球菌的应用范围奠定基础。　关键词：乳酸乳球菌；电转化；电压／电阻；生长时期；电击缓冲液　中图分类号：Ｑ９３９．９　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１３）Ｏ８—００３４—０３　乳酸菌（１ａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ＬＡＢ）是一类广泛分布于自然　界，在工业、农业和医学等领域与人类生活密切相关，微好氧，　游的部分开放阅读框、多克隆位点、来自乳酸乳球菌乳脂亚种　蛋白酶基因的转录终止子及ＰＷＶ０１复制子、红霉素抗性基因　Ｅｍｒ等组成。近来，科研工作者以ｐＭＧ３６ｅ为基本质粒进行　了很多改造，如加上ｌａｃＺ基因、Ｎｓｒ基因、Ｎｉｓｉｎ基因等，替代　原有的红霉素抗性，使该质粒得到了更深入的应用　。　由于乳酸乳球菌属于革兰氏阳性菌，具有厚且致密的刚　能够发酵碳水化合物、产生乳酸的革兰氏阳性菌。乳酸菌包　括乳球菌和乳杆菌，其中乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）是乳　球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）中最重要、最典型的一个种，乳酸乳球菌　为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，细胞对称生长，因易于培养、　生长迅速等优点而成为表达外源基因的理想菌株，因此常作　性细胞壁，常规的化学方法无法使外源ＤＮＡ进人受体细胞。　目前，乳酸菌转化外源ＤＮＡ的方法主要有原生质体转化法和　电转化法。原生质体转化法操作繁琐、耗时较长、转化效率　为乳酸菌基因工程受体菌的标准菌株。与目前日益完善的大　肠杆菌、酵母菌表达系统相比，乳酸菌的分子生物学研究起始　较晚。但是近年来，随着乳酸菌各类表达元件的分离，相　继发展了一批适用于乳酸菌的克隆载体与表达载体　。　ｐＭＧ３６ｅ是最常用于乳酸乳球菌的一种表达型质粒，１９８９年　由Ｖａｎｄｅｒ等学者构建成功　，可在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）与乳酸　菌中进行复制，质粒大小为３．６１　ｋｂ，由强启动子Ｐ３２及其下　收稿日期：２０１３—０１—１７　基金项目：农业部转基因生物新品种培育重大专项（编号：　低，而电转化法则具有省时、简便、受体范围广泛等优点，已成　为目前乳酸菌转化的主导方法。然而影响电转化效率的因素　较多，如乳酸菌是否经过前期处理（甘氨酸、溶菌酶、醋酸锂、　ＤＴｒ等）　、乳酸菌所处的生长周期及电转化的参数都会对　转化效率产生重要影响　。因此，本试验以乳酸乳球菌为研　究对象，从影响电转化效率的几个因素人手，探讨常用乳酸菌　质粒ｐＭＧ３６ｅ转化到乳酸乳球菌中的效率，建立并优化乳酸　乳球菌的电转化方法，为后期乳酸菌的深入研究和广泛应用　奠定基础。　１材料与方法　２０１１ＺＸ０８００６一ＯＯ４）；江苏省农业科技自主创新资金［编号：ＣＸ　（１Ｏ）４２１］。　作者简介：于建宁（１９８Ｏ一），女，山东烟台人，博士，副研究员，主要从　事动物发育生物学研究。Ｔｅｌ：（０２５）８４３９０３４１；Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｎｎｉｎｇｙｕ　＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｅｒｌ。　１．１培养基的配制　通信作者：王公金，博士，研究员，主要从事动物胚胎工程研究。　Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｇｊｐｈｄ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ。　ＧＭ１７液体培养基：分别称取大豆蛋白胨５　ｇ、胰蛋白胨　５　ｇ、酵母浸提物２．５　ｇ、维生素Ｃ　０．５　ｇ、ＭｇＳＯ４　０．２５　ｇ、磷酸氢　１：ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｄ　ｒａａｂｂｉｔ　ｍＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　［２］庞有志．家兔的实验动物学价值［Ｊ］．中国养兔，２０１１（９）：１５一ｌ８．　［３］张志，杜若甫．磷酸葡萄糖变位酶１的群体遗传学研究［Ｊ］．　ｔｈｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｌ［Ｊ］．Ｐｒｏ—　ｅｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　国外医学：遗传学分册，１９８９（２）：６１—６７．　［４］伍新尧，郭云荣，陈丽娴，等．精液／斑的ＰＧＭ－１亚型分型研究　［Ｊ］．中山医科大学学报，１９８８，９（４）：６５—６７．　［５］Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｇ　Ｒ，ＭｃＡｌｐｉｎｅ　Ｐ　Ｊ，Ｈａｍｅｒｔｏｎ　Ｊ　Ｌ．Ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｃｉ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ＰＧＭ　ａｎｄ　６ＰＧＤ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｎｅ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，１９９２，８９（１）：４１１—４１５．　［７］陈良忠，颜永杉．我国几个民族中毛发根葡萄糖磷酸变位酶一１　的亚型分布［Ｊ］．人类学学报，１９８４，３（３）：２８５—２８９．　［８］Ｈｕ　Ｊ，Ｄｕ　Ｒ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ　１（ＰＧＭ１）ｉｎ　ｆｉｖｅ　Ｈａｎ　ｓｕｂｐｏｐｕｌ￣ｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ　Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ，１９９５，９（１）：　ｌ一４．　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ—ｈｕｍａｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｆ　ｏｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，　１９７３，７０（１０）：２７３７—２７４０．　［９］魏小文，韦石松，齐和平，等．肿瘤患者血清ＰＧＭ测定结果分析　［Ｊ］．海军医学，１９９４（１）：４９—５１．　［６］Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ　Ｄ　Ｂ，Ｐｕｔｔ　Ｗ，Ｌｏｖｅｇｒｏｖｅ　Ｊ　Ｕ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔｓｅ　ａ江苏农业科学２０１３年第４１卷第８期　１．６乳酸乳球菌的电转化　一３５一　二钾１０　ｇ、甘油１０　ｇ、乳糖５　ｇ、葡萄糖５　ｇ，加入８００　ｍＬ　ｄｄＨ：０，调节ｐＨ值至６．２，定容至１　Ｌ，高压灭菌ｌ５～２０　ｍｉｎ。　ＧＭ１７固体培养基：量取１００　ｍＬ　ＧＭ１７液体培养基，加入　１．５～２　ｇ琼脂粉，搅拌均匀后，１２１　ｏＣ、高压灭菌１５—２０　ｒａｉｎ。　取１Ｏ　电击。　ｐＭＧ３６ｅ与感受态ＭＧ１３６３混合，冰浴１０　ｍｉｎ，　首先在电阻２００　Ｑ下选择不同电压（１．０～２．５　ｋＶ）条件　进行电转化；再在转化效率最高的电压下选择不同电阻（２００—　ＳＧＭ１７高渗培养基：称取１０　ｇ蔗糖置于烧杯中，加入　ＧＭ１７液体培养基溶解，定容至１００　ｍＬ，高压灭菌，４℃保存。　ＳＧＭ１７ＭＣ恢复培养基：１０　ｍＬ无菌ＳＧＮ１７高渗培养基　在临用前加入２　ｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ１２　１００　Ｌ、０．５　ｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１２　４０　，　混匀后４℃保存。　洗涤液Ｉ（ＥＢ）：称取１０　ｇ蔗糖于烧杯中，加入１０　ｍＬ甘　油，加入一定量的水溶解，定容至１００　ｍＬ。　洗涤液Ⅱ：称取１０　ｇ蔗糖于烧杯中，加入１０　ｍＬ甘油，加　入一定量的水溶解，加入２　ｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇｃｌ：１　ｍＬ，高压灭菌。　电击缓冲液（ＰＥＢ）：取１００　ｍＬ的洗涤液，加入２Ｏ　磷　酸缓冲液，使磷酸缓冲液终浓度为５　ｍｍｏｌ／Ｌ。　１．２大肠杆菌ＤＩ－Ｉ５￣的感受态的制备　（１）挑取大肠杆菌单克隆至４　ｍＬ　ＬＢ管中，３７℃摇菌过　夜。（２）将４　ｍＬ菌液转接至１００　ｍＬ无抗生素ＬＢ培养基，　３７℃摇菌约２—３　ｈ，期间准备ＴＢＳ溶液，按表１配方准备　１０　ｍＬＴＳＢ液。（３）将１００　ｍＬ菌液转移至５０　ｍＬ离心管中，　４℃下３　０００　ｇ离心５　ｍｉｎ，倒掉上清，在冰浴条件下吹打重悬　于１０　ｍＬＴＢＳ液中，置冰上１０　ｍｉｎ。（４）将细菌悬液快速地　分装至若干个已灭菌、预冷的０．５　ｍＬ离心管中（每管装　５５　），放于一７０℃低温冰箱保存。　表１大肠杆菌感受态Ｔ】珞溶液配制　１．３大肠杆茵的转化　取出质粒ｐＭＧ３６ｅ，取出冻存的５×ＫＣＭ贮存液ｌＯｌＬ、水　３０　、ＤＮＡ（连接产物）ｌ０　，共计５Ｏ　，吹打混匀后置　６５　ｑＣ水浴１０　ｒａｉｎ。将感受态菌液全部加至１　ＸＤＮＡ混合物　中，轻轻旋转混匀，在冰中放置２０　ｍｉｎ，取出后置室温１０　ｍｉｎ，　加入４００　无抗生素的ＬＢ液体培养至上述的感受态细　￣／ＤＮＡ混合物中，置３７℃摇床慢速摇菌１　ｈ，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ　离心３０　ｓ，弃上清。吹打残液重悬沉淀，将菌液全部转移到　ＬＢ平板，涂布均匀。倒置平板于３７℃过夜培养１２～１６　ｈ。　１．４　ｐＭＧ３６ｅ的大量提取　挑取状态良好的菌落在ＬＢ液体培养基中扩大培养，采　用质粒提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行大量　抽提备用。　１．５乳酸乳球菌ＭＧ１３６３感受态的制备　接种ＭＧ１３６３于ＧＭ１７培养基，３０℃培养过夜，按５％接　种量接种于含１％甘氨酸的高渗ＧＮ１７培养基（ＳＧＭ１７）至吸　光度为０．２、０．４、０．６、０．８，培养结束后将细菌培养物冰浴　１０　ｒａｉｎ，离心收集菌体，用冰冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体３　次，最后采用菌液体积１／１００的电击缓冲液重悬菌体。　８００　ｎ）条件电击感受态细胞，在恢复培养基ＳＧＭ１７ＭＣ中培　养３　ｈ后，取２００　涂于含有１０￣ｇ／ｍＬ红霉素的平板上，　３０℃静置培养１～２　ｄ后，观察结果。根据质粒ＤＮＡ浓度，　计算单位质量ＤＮＡ所得的转化子个数（　ｇ），即转化效　率，每项条件优化做３次重复试验。　将质粒转化处于不同对数期的乳酸乳球菌ＭＧ１３６３试验　菌株的感受态在恒定电压和电阻条件下进行电击，同样在恢　复培养后涂板，计算转化效率。　制备对数生长中期的乳酸乳球菌ＭＧ１３６３，分别用２种　电击缓冲液（ＰＥＢ和ＥＢ）重悬菌体，在恒定电压和电阻条件　下进行电击，同样在恢复培养后涂板，计算转化效率。　２结果与分析　２．１　电压与电阻对乳酸乳球菌ＭＧ１３６３电转化的影响　选择乳酸乳球菌ＭＧ１３６３对数生长期制备感受态，在不　同电压和不同电阻条件下进行转化。图１显示，当电压为　２．０　ｋＶ时转化效率最高，达３６０个／　ｇ。图２显示，当电阻为　４００　ｎ时转化效率最大，达１　２００个／　ｇ。　瓣　薹　辩　１．０　１．５　２．０　２．５　电压（ｋ、，）　圈１电压对电转化效率的影响　１　—齑　ｉ　毛　瓣　较　样　２００　４００　６００　８００　电阻（Ｉ１）　图２电阻对电转化效率的影响　２．２细茵对数生长期的选择　由图３可以看出，随着细菌培养时间的延长，转化效率增　加，至对数期后期转化效率降低，细菌在培养至对数中期时转　化效率最高，达１　２００　ｇ，这可能是因为对数生长中期细　胞生长旺盛，细胞壁结构相对疏松，有利于电击时孔洞的形　成，从而使电击时转化效率升高。　２．３　电击缓冲液对转化效率的影响　用２种电击缓冲液ＰＥＢ和ＥＢ分别转化对数生长中期的　一３６一　江苏农业科学２０１３年第４１卷第８期　在电转化中还涉及到电击缓冲液的问题，一般常用介质　重　瓣　较　蜱　有甘油蔗糖溶液、磷酸盐缓冲液或蒸馏水，这些介质均能用于　电转化，但不同细菌在不同介质中的转化效率显然是有差别　的。１０％甘油蔗糖溶液（ＥＢ）转化效率并不理想，加入适量浓　度的磷酸缓冲液（ＰＥＢ）能提高电转化效率；但在高电压的情　况下，尽量选用离子浓度低甚至不含离子的电击液，这样在高　电压下细菌不易被击穿，可提高转化效率　。在本试验条件　下，ＥＢ中的转化效率显著低于ＰＥＢ，进一步证实了上述的一　吸光度　图３　不同生长时期细胞对转化率的影响　般规律。　除以上所述的影响因素之外，外源ＤＮＡ进入乳酸菌的其　他屏障还包括质粒本身的大小与浓度、抗生素筛选的浓度、乳　乳酸乳球菌，结果如图４所示。用ＰＥＢ作电击缓冲液的转化　效率显著高于ＥＢ缓冲液，前者的转化效率为１　３００个／　ｇ，后　者则为２００个／　ｇ，两者几乎差一个数量级。　１　６００　１　４００　●Ｉ１　２００　１　０００　羹：０。０。　辩４００　２００　Ｏ　ＥＢ　Ｐ髓　缓冲液　图４不同电击缓冲液对转化效率的影响　３讨论　乳酸乳球菌属于革兰阳性菌，外源ＤＮＡ很难直接进入细　胞内，用氯化钙法、ＫＣＭ法等化学方法转化均未得到阳性菌　株，因此采用电转化法。由于乳酸菌电转化具重复性差、转化　效率低等缺点，因此本试验利用质粒ｐＭＧ３６ｅ转化乳酸乳球　菌ＭＧ１３６３研究影响电转化效率的因素，为后续开展深入研　究奠定基础。　电穿孑Ｌ作用利用瞬间高压击打细胞膜，使之形成孔洞，使　ＤＮＡ分子得以进入细胞…　。在电击过程中，若电压过低，则　细胞难以极化产生孔洞，ＤＮＡ不能进入；若电压过高，则细胞　会因细胞膜损伤过大而死亡，从而导致转化效率的降低，因此　在电转化过程中电压条件的优化极为关键。在试验中，一般　常用０．２　ａｍ的电击杯，微生物电转化过程电压一般在１．２—　２．４　ｋＶ之间，但不同的乳酸菌菌株的最适电压存在很大差　异。例如，干酪乳杆菌的最高转化效率为电压２．４　ｋＶ　，而　副干酪乳杆菌则须电压控制在１．８　ｋＶ　，而本试验中乳酸乳　球菌ＭＧ１３６３的最佳电压是２．０　ｋＶ。电阻也是影响电转化效　率的一个重要参数，但是影响较电压小。本试验结果表明，在　４００　Ｑ时转化乳酸乳球酸ＭＧ１３６３得到的转化效率最高，这　与孙磊等转化乳酸乳球菌ＭＧＩ６１４的试验结果　是一致的。　不同生长时期的细菌对电击的敏感程度存在着显著差　异。有研究表明，干酪乳杆菌、土壤杆菌、棒杆菌类、各种葡萄　球菌以及一些芽孢杆菌培养到对数中期时电转化效率最　高　，然而有些革兰阳性细菌，如乳链球菌、短芽孢杆菌和　梭状芽孢杆菌等则培养到静止期或静止前期最适于电转　化　。乳酸乳球菌ＭＧ１３６３也是处于对数生长中期的电转　化效率最高。之所以存在这种差异，可能是因为菌种之间的　细胞壁结构不同。　酸菌菌株内部的系统，载体和受体菌本身固有质粒的不　相容性等，因此在对某种乳酸菌进行电转化之前，必须优化这　些条件，　才能使后续试验达到理想的效果。　参考文献：　［１］ｄｅ　Ｖｏｓ　Ｗ　Ｍ．Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，２（３）：２８９—２９５．　［２３ｖａｎ　ｄｅ　Ｇｕｃｈｔｅ　Ｍ，ｖａｉｌ　ｄｅｒ　Ｖｏｓｓｅｎ　Ｊ　Ｍ，Ｋｏｋ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌａｅｔｏｃｏｅｃａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｎ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｉｎ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．１ａｅｔｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，５５（１）：２２４—２２８．　［３］陈秀清，胡海菁，，等．乳链菌肽前体基因（ｎｉｓＺ）在乳酸乳　球菌中的克隆和表达［Ｊ］．遗传学报，２００１，２８（３）：２８５—２９０．　［４］丁寅寅，马会勤，左芳雷，等．乳酸菌载体ｐＭＧ３６ｅ的应用现状　［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００９，２９（１１）：１０６—１１１．　［５］贺松，龚芳红，张德纯，等．嗜酸乳杆菌Ｂ一半乳糖苷酶基因的　克隆及其作为食品级筛选标记的研究［Ｊ］．食品与生物技术学　报，２０１０，２９（５）：７７７—７８１．　［６］张莉，秦泽荣，崔尚金，等．柔嫩艾美耳球虫ＴＡ４抗原基因　ｃＤＮＡ在乳酸乳球菌中的克隆与表达［Ｊ］．中国预防兽医学报，　２００６，２８（３）：２７１—２７４．　［７］ＢｕｅｋｌｅｙＮＤ，ＶａｄｅｂｏｎｅｏｅｕｒＣ，ＬｅｂｌａｎｃＤ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｅｆｆｅｅｔｉｖｅ　ｓｔｒａｔｅ。　ｇｙ，ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｔｏ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｏ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｏｒ　ｃｏｎｆｅｒ　ｅｌｅｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉ－　ｒｏｎｍｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，６５（９）：３８００—３８０４．　［８］Ｈｏ　Ｐ　Ｓ，Ｋｗａｎｇ　Ｊ，Ｌｅｅ　Ｙ　Ｋ．Ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　ｇａｓｔｍｅｎｔｒｉｔｉｓ　ｃｏｒｏｎＲｖｉｒｕｓ　ｓｐｉｋｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００５，２３　（１１）：１３３５—１３４２．　［９］Ｐａｐａｇｉｎａｎｉ　Ｍ，Ａｗａｍｉｄｉｓ　Ｎ，Ｆｉｌｉｏｕｓｓｉｓ　Ｇ．Ｈｉｇｈ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓ—　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｏ￣ｔｃｏｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｐｐ．１ａｃｔｉｓ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｔｈｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ａｎｄ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，７：１５．　［１０］格日勒图，王艳霞，包秋华，等．电转化方法将外源性质粒导入　干酪乳杆菌的研究［Ｊ］．中国乳品工业，２００９，３７（２）：９～１３．　［１１］Ｍｅｉｌｈｏｃ　Ｅ，Ｍａｓｓｏｎ　Ｊ　Ｍ，Ｔｅｉｓｓｉ６　Ｊ．Ｈｉｓｈ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔａｃｔ　ｙｅａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｉｅｌｄ　ｐｕｌｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ），１９９０，８（３）：２２３—２２７．　［１２］葛菁萍，高先军，由田，等．副干酪乳杆菌ＨＤＩ．７遗传转化体　系的初步建立［Ｊ］．中国农学通报，２０１１，２７（２３）：１０２—１０８．　［１３］孙磊，孔文涛，孔健．乳酸乳球菌电转化条件的研究［Ｊ］．　山东大学学报：理学版，２００５，４０（３）：１２１—１２４．　［１４］陈乃用．电穿孔法在细菌质粒转化中的应用［Ｊ］．微生物学通　报，１９９ｌ，１８（２）：９７—１０３，