包涵体蛋白3种纯化方法的比较
目的 比较3种纯化方法对表达的肠道病毒71型（EV71）VP1区包涵体蛋白的纯化效果。 方法 分别用差速离心法、固定化金属离子亲和层析（IMAC）及不同浓度饱和硫酸氨沉淀法3种包涵体蛋白纯化法对原核表达EV71 VP1包涵体蛋白进行纯化，蛋白垂直（SDS-PAGE）电泳检测蛋白纯化效果。 结果 差速离心法可以进行大批量表达蛋白纯化，纯化效果较好，但存在蛋白损失较多，且纯化蛋白不能反复冻融的问题。IMAC柱纯化获得的蛋白纯度较高，且蛋白性状稳定，但仍存在纯化蛋白量较少的问题。饱和硫酸氨沉淀纯化法无法获得纯度较高的包涵体蛋白。 结论 差速离心法可用于大批量蛋白纯化，纯化蛋白应避免反复冻融，可小量分装冻存后备用。IMAC柱纯化可获得纯度较高且性状相对稳定的纯化蛋白，其在相应抗体检测方法学的建立及疫苗制备方面均有广泛用途。饱和硫酸氨法只适用于表达蛋白的初步浓缩纯化。
[Abstract] Objective To compare the expressed inclusion body protein of EV71 VP1 with three purification methods. Methods The expressed EV71 VP1 inclusion body protein was purified by differential centrifugation， IMAC column purification and ammonium sulfate precipitation. SDS-PAGE experiments determinate the purity effects. Results Expressed inclusion body purification in large quantities could been undertaken by differential centrifugation and the purification effect was better but with a lot of protein loss and the purified protein could not be repeatedly frozen and thawed. The purification effect of IMAC was good and stable， but less purified protein was purified. High purity of inclusion body protein wasn’t obtained by ammonium sulfate precipitation. Conclusion Differential centrifugation is applicable in large quantities of protein purification， but avoid repeatedly freezing and thawing. The protein purification of IMAC can be used to establish corresponding antibody detection methods. The ammonium sulfate precipitation is only applicable for the preliminary purification of the expressed proteins.
[Key words] Inclusion body protein； Protein purification； SDS-PAGE electrophoresis
包涵体是外源基因在细胞中表达量过高形成的一种膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒。该蛋白不具有生物学活性，其分子的空间结构表现为非折叠态的聚集体，复性后可恢复其生物学活性[1]。研究发现外源基因低表达时很少形成包涵体，蛋白表达合成速度越快、量越高越容易形成包涵体[2-4]。包涵体纯化方法有色谱法、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、双水相萃取技术、反胶团相转移技术、凝胶过滤层析等[5-13]，不同的方法间纯化效果有明显差异。为寻找一种简单、快速的纯化方法，本研究用3种实验室常用的包涵体蛋白纯化方法对肠道病毒71型（EV71）VP1包涵体蛋白进行纯化，并对其纯化效果进行比较，希望能为相关抗体检测试剂盒的研制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXIOD公司，30%丙烯酰胺购自美国NOVON公司， IMAC纯化柱购自北京天恩泽科技有限公司，化学试剂购自北京化学试剂公司。
1.2 重组质粒的构建及表达
EV71 VP1重组表达质粒的构建、表达均由第三〇二医院临床研究管理中心（以下简称“本院”）完成[14-18]。
1.3 表达蛋白可溶性鉴定
EV71 VP1包涵体蛋白7000 r/min 4℃离心10 min后，沉淀溶于30 mL PBS中，反复冻融3次后，冰浴条件下超声20次。分离上清和沉淀进行蛋白垂直（SDS-PAGE）电泳，观察表达蛋白均为包涵体蛋白。
1.4 差速离心纯化包涵体蛋白
取10 mL包涵体蛋白液，1000 r/min，4℃离心30 min后，弃沉淀，上清7000 r/min 4℃离心10 min后，沉淀溶于10 mL PBS中；1000 r/min 4℃离心30 min后，上清7000 r/min 4℃离心10 min，反复差速离心至包涵体蛋白出现瓷白色。SDS-PAGE电泳检测纯化效果。1.5 IMAC纯化柱纯化包涵体蛋白
取10 mL包涵体蛋白液，7000 r/min 4℃离心10 min后，沉淀溶于4 mL结合液中，上柱与Ni-Agarose介质结合2 h，结合液洗柱3次后分别用40、60、80、100、150、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脱结合蛋白，SDS-PAGE电泳检测纯化效果。
1.6 不同浓度饱和硫酸氨纯化包涵体蛋白
取9管1 mL包涵体蛋白液，震荡滴加饱和硫酸氨，使饱和硫酸氨终浓度分别为10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，置4℃冰箱2 h后7000 r/min，4℃离心10 min，沉淀用1 mL PBS溶解后加饱和硫酸氨液体使其终浓度达到上述浓度进行沉淀，反复3次溶解、沉淀后，沉淀溶于1 mL PBS中，SDS-PAGE电泳检测其纯化效果。
2 结果
2.1 差速离心纯化
EV71 VP1重组质粒诱导表达前在33 kD处未见蛋白表达带；诱导表达6 h后在33 kD处可见一条高浓度的蛋白表达带，且杂蛋白较多；经反复差速离心纯
化获得的蛋白，其纯化效果较好，仅在33 kD处有一条高浓度的蛋白带，无杂蛋白带，但目的蛋白损失较多，其得率仅为1%。见图1。
2.2 包涵体纯化试剂纯化
IMAC柱纯化效果较好，其中150 mmol/L咪唑溶液洗脱效果最好，获得的纯化蛋白浓度最高。因洗脱的蛋白液含不同浓度的咪唑会对SDS-PAGE电泳产生影响导致Marker跑偏，且咪唑洗脱蛋白电泳结果比用PBS稀释的蛋白分子量小。见图2。
2.3 不同浓度饱和硫酸氨纯化
将包涵体蛋白分别用不同浓度的饱和硫酸氨纯化，摸索纯化最佳条件，包涵体蛋白会随着饱和硫酸氨浓度的增加损失增多，而杂蛋白含量无明显变化。见图3。
3 讨论
原核蛋白表达系统是目前最常用的蛋白表达系统，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和分离纯化表达产物相对简单等优点，但仍存在表达外源蛋白易形成包涵体的问题，其原因主要为：①蛋白合成速度太快导致新生多肽无法折叠；②缺少糖基化等修饰使蛋白中间体大量积累形成包涵体；③培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素导致包涵体形成；④大肠杆菌不易形成二硫键，而二硫键在蛋白折叠中有重要作用。但因包涵体蛋白表达水平高、相对较纯且易分离纯化等优点，包涵体蛋白表达仍在商业化生产中得到广泛应用。
本研究从前期EV71 VP1重组基因VP1蛋白表达入手，摸索了很多表达条件[温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyrano-side，IPTG）不同浓度的摸索等]均不能获得EV71 VP1蛋白的可溶性表达。随后，为探索包涵体蛋白的纯化方法，本研究从本室制备的包涵体入手，分别尝试了3种纯化包涵体蛋白方法，希望从中找出快速、高效的纯化方法为后续研究提供帮助。结果显示差速离心法可大批量的纯化包涵体蛋白，纯化效果较好，可用于动物免疫需大批量蛋白时用。但该纯化法存在蛋白损失较多、纯化蛋白不能反复冻融的问题，目前主要通过小量分装冻存来避免。IMAC柱纯化法纯化效果较好，纯化蛋白性状稳定，适用于试剂盒方法学的研究[19-20]。但该法仍存在纯化柱较贵，且每次只能纯化少量包涵体蛋白，纯化蛋白需透析脱盐处理，易造成蛋白变性、浓度降低，特别是在动物免疫时不能满足要求等问题[6]。不同浓度饱和硫酸氨纯化法无法获得纯度较高的包涵体蛋白。
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