一种植物抗虫基因及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104630260 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.05.20

(21)申请号 201310571740.6(22)申请日 2013.11.13

(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院

地址200031 上海市徐汇区岳阳路319号(72)发明人苗雪霞 薛红卫 郭惠民 周时荣(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公

司 31100

代理人陈静(51)Int.Cl.

C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)

权利要求书1页 说明书12页

序列表4页 附图5页

(54)发明名称

一种植物抗虫基因及其应用(57)摘要

本发明涉及一种植物抗虫基因及其应用。本发明人从抗虫性水稻植株中找到了对有害昆虫具有抗生作用的抗虫基因。所述基因可用于制备对昆虫有抗性的转基因植物，或在育种领域作为一种筛选抗虫植物的分子标记。

C N 1 0 4 6 3 0 2 6 0 ACN 104630260 A

权 利 要 求 书

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1.一种提高植物抗虫性的方法，包括：将AOC4多肽或OPR7多肽的编码基因导入植物中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有AOC4多肽或OPR7多肽的编码基因；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使AOC4多肽或OPR7多肽的编码基因转入植物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的OPR7多肽选自下组：(a)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽具有70%以上的序列相似性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AOC4多肽选自下组：(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽具有70%以上的序列相似性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AOC4多肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；或所述的OPR7多肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。

6.AOC4多肽或OPR7多肽或它们的编码基因的用途，其特征在于，用于提高植物抗虫性；或用于作为判断植物抗虫能力的分子标记。

7.一种鉴定植物的抗虫能力方法，包括：检测待测植物中AOC4多肽或OPR7多肽的表达；若待测植物中AOC4多肽或OPR7多肽的表达量高于感虫植物中该多肽的表达量；则该种植物是具有抗虫能力的植物。

8.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的植物是禾本科植物。9.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的昆虫是同翅目昆虫(Homoptera)或鳞翅目昆虫(Lepidoptera)。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的昆虫是同翅目飞虱科(Delphacidae)昆虫，或鳞翅目螟蛾科昆虫(Pyralididae)。

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CN 104630260 A

说 明 书

一种植物抗虫基因及其应用

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技术领域

[0001]

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗虫基因及

其应用。背景技术

水稻(Oryza sativa，L.)是我国最重要的粮食作物，水稻的高产与优质直接关系

到我国的粮食安全。稻飞虱一直是影响水稻安全生产的一个重要制约因素。因此，发展安全有效的稻飞虱控制措施，是保障水稻安全生产的一个重要方面。[0003] 利用抗性品种可以降低稻飞虱的繁殖速度，从而有效控制稻飞虱危害，减少化学农药的用量，保护稻田生态系统。由于稻飞虱是迁飞性害虫，每年迁入我国的虫量毕竟有限，大量的研究表明，稻飞虱暴发成灾主要与其进入稻田生态系统后的高增长倍数有关。影响稻飞虱增长倍数的主要因子，除了耕作制度、气候条件、农药及化肥外，一个很重要的原因就是水稻品种的抗性。由于农药防治往往导致害虫再增猖獗及害虫抗药性的不断提高，因此利用抗性品种一直是害虫综合治理中最重要的措施之一(程家安，2006；2008)。然而，由于在生产上过度强调水稻高产，而对稻飞虱防治又过度依赖于农药，导致了目前抗稻飞虱的水稻品种严重缺乏。如我国近年育成推广的杂交水稻品种中，具有抗飞虱性能的仅占1.5%。因此，培育抗稻飞虱的水稻品种已成为减少稻飞虱危害的当务之急。[0004] 相对于传统育种而言，分子育种具有选育周期短，针对性强的优点。尽管抗螟虫的“华恢1号”和“Bt汕优63”获得了在湖北省的生产应用安全证书，但目前在公众中还存在一系列的争议。争议的焦点仍然是含有Bt这种外源毒蛋白基因的生物安全问题。这就要求本发明人首先要从水稻自身存在的抗虫基因中寻找目标基因。[0005] 就水稻自身对稻飞虱的抗性基因而言，目前已经定位的抗褐飞虱基因有26个，其中有些基因已经通过常规选育或分子标记辅助筛选的方法用于抗性品种的培育。2009年底，中国武汉大学的何光存教授课题组，通过十多年的不懈努力，首先克隆出了水稻抗褐飞虱基因Bph14，初步阐述了该基因的抗性机理，并从蛋白组学水平进行了抗性机理的分析。目前相关研究团队已经利用该基因培育了几个抗飞虱的水稻品种。考虑到稻飞虱对基因产生抗性的速度非常快，仅仅利用一个或几个基因是完全不够的，需要研究人员去不断发现、验证和利用新的抗虫基因。

[0002]

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种植物抗虫基因及其应用。[0007] 在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗虫性的方法，包括：将AOC4多肽或OPR7多肽的编码基因导入植物中。

在一个优选例中，所述的方法包括：

[0009] (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有AOC4多肽或OPR7多肽的编码基因；

[0008]

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说 明 书

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(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使AOC4多肽或

OPR7多肽的编码基因转入植物。[0011] 在另一优选例中，所述方法还包括：

[0012] (3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和[0013] (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。[0014] 在另一优选例中，所述的OPR7多肽选自下组：[0015] (a)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽；

[0016] (b)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制或驱避昆虫功能的由(a)衍生的多肽；

[0017] (c)与SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽具有70%以上(较佳地80%以上；更佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地98%以上；更佳地99%以上)的序列相似性，且具有抑制或驱避昆虫功能的由(a)衍生的多肽。[0018] 在另一优选例中，所述的AOC4多肽选自下组：[0019] (a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

[0020] (b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制或驱避昆虫功能的由(a)衍生的多肽；

[0021] (c)与SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽具有70%以上(较佳地80%以上；更佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地98%以上；更佳地99%以上)的序列相似性，且具有抑制或驱避昆虫功能的由(a)衍生的多肽。[0022] 在另一优选例中，所述的AOC4多肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；或所述的OPR7多肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。[0023] 在本发明的另一方面，提供由所述的提高植物抗虫性的方法获得的转基因植物。[0024] 在本发明的另一方面，提供AOC4多肽或OPR7多肽或它们的编码基因的用途，用于提高植物抗虫性；或用于作为判断植物抗虫能力的分子标记。[0025] 在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗虫能力方法，包括：检测待测植物中AOC4多肽或OP R7多肽的表达；若待测植物中AOC4多肽或OPR7多肽的表达量高于(较佳地为在统计学上高于，如高20%以上；更佳地高50%以上；更佳地高80%以上)感虫植物中该多肽的表达量；则该种植物是具有抗虫能力的植物。[0026] 在另一优选例中，采用SEQ ID NO:5和6，或采用SEQ ID NO:7和8的引物，通过PCR鉴定所述多肽的编码基因的转录情况，从而得知该多肽的表达情况。[0027] 在另一优选例中，所述的植物是禾本科植物。[0028] 在另一优选例中，所述的昆虫是同翅目昆虫(Homoptera)或鳞翅目昆虫(Lepidoptera)。

[0029] 在另一优选例中，所述的同翅目昆虫包括但不限于：褐飞虱(Nilaparvata lugens)、白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Laodelphax striatellus)。[0030] 在另一优选例中，所述的鳞翅目昆虫包括但不限于：稻螟虫，如二化螟(Chilo suppressalis)。

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说 明 书

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在另一优选例中，所述的昆虫是同翅目飞虱科(Delphacidae)昆虫，或鳞翅目螟

蛾科昆虫(Pyralididae)。

[0032] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0033] 图1、AOC4基因在抗虫品种RHT和感虫品种TN1中的差异表达。[0034] 图2、AOC4和OPR7基因参与的代谢通路及其超表达株系。[0035] A．茉莉酸代谢通路，显示AOC和OPR7是代谢通路中最后两个关键酶；B.AOC4的4个超表达株系，与野生型相比，4个株系OE2，OE7，OE14和OE25的超表达倍数分别为36，40，53和69倍；C.OPR7的4个超表达株系，与野生型相比，4个株系OE1，OE14，OE26和OE35的超表达倍数分别为45，12，8和16倍。[0036] 图3、AOC4和OPR7基因超表达株系的苗期抗飞虱鉴定结果。[0037] 图4、AOC4和OPR7基因超表达株系的分蘖期抗飞虱鉴定结果。[0038] 图5、稻飞虱在AOC4和OPR7基因超表达株系上取食后排泄的蜜露量。[0039] 图6、稻飞虱在AOC4和OPR7基因超表达株系上生长及存活。[0040] 图7、稻螟虫在AOC4和OPR7基因超表达株系上生长及危害情况。具体实施方式

[0041] 本发明人经过广泛的研究，从抗虫性水稻植株中找到了对有害昆虫具有抗生作用(具有抗虫性)的抗虫基因。所述基因可用于制备对昆虫有抗生作用的转基因植物，或在育种领域作为一种筛选抗虫植物的分子标记。[0042] 术语

[0043] 如本文所用，所述的“植物”没有特别的，只要所述“植物”是易于被昆虫(如同翅目昆虫或鳞翅目昆虫)侵害的，如各种农作物花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：棉花、小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。在本发明的实施方式中，例示了禾本科的植物。[0044] 如本文所用，所述的“昆虫”是指可由本发明的AOC4基因或OPR7基因或其杀灭或抑制的任何昆虫。例如：同翅目的昆虫或鳞翅目昆虫。[0045] 如本文所用，所述的“感虫植物”是指对昆虫没有抗生作用的植物，对于某种昆虫，在鉴定对其有抗生作用的植物的方法中，感虫植物一般选自与待鉴定植物同属的植物，例如鉴定对水稻飞虱有抗生作用的水稻，可选择水稻感虫品种Taichung Native1。当需要鉴定一种待测植物是否具有抗生作用时，以与待测植物同属或同类的感虫植物中AOC4蛋白的一般或平均表达量作为判定的“阈值”，高于该“阈值”则可认为待测植物具有抑制昆虫的

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说 明 书

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能力。

AOC4、OPR7及其编码基因

[0047] 本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，植物、细菌、酵母、昆虫细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发

[0046]

明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

[0048] 本发明还包括AOC4或OPR7蛋白(多肽)或的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的AOC4或OPR7蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

[0049] 任何一种AOC4或OPR7蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，AOC4或OPR7蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的AOC4或OPR7蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长AOC4或OPR7蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长AOC4或OPR7蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的活性。[0050] 在本发明中，术语“AOC4蛋白”指SEQ ID NO:2序列的多肽或其同功能的变异形式。术语“OPR7蛋白”指SEQ ID NO:4序列的多肽或其同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括AOC4或OPR7蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突

变体、在高或低的严紧度条件下能与AOC4或OPR7蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含AOC4或OPR7蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了AOC4或OPR7蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有AOC4或OPR7蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

[0052] 发明还提供AOC4或OPR7蛋白的类似物。这些类似物与天然AOC4或OPR7蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

[0051]

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说 明 书

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在本发明中，“AOC4蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，

有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。“OPR7蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

[0054] 本发明所述的AOC4基因在植物体内表达后，植物就会具有对有害昆虫(如稻飞虱)的抗生作用。其次，在大量表达了这种基因的植株上，有害昆虫的存活率可显著降低或迁移或死亡，因此，基于该目标基因，可设法让其在植物中大量表达或定时表达，从而有效抵抗有害昆虫的危害。[0055] 表1

[0056]

氨基酸残基代表性的取代Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)

Val；Leu；IleLys；Gln；AsnGln；His；Lys；ArgGluSerAsnAspPro；Ala

Asn；Gln；Lys；ArgLeu；Val；Met；Ala；PheIle；Val；Met；Ala；PheArg；Gln；AsnLeu；Phe；Ile

Leu；Val；Ile；Ala；TyrAla

优选的取代ValLysGlnGluSerAsnAspAlaArgLeuIleArgLeuLeuAla

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CN 104630260 A

Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V)

[0057]

ThrSerTyr；Phe

说 明 书

ThrSerTyrPheLeu

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Trp；Phe；Thr；SerIle；Leu；Met；Phe；Ala

本发明还提供了编码本发明AOC4基因或其保守性变异多肽的多核苷酸。

[0058] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟AOC4多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。编码成熟OPR7多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。[0059] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

[0060] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

[0061] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。[0062] 应理解，虽然本发明的AOC4基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与AOC4基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。[0063] 本发明的编码AOC4基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。[00] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

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说 明 书

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本发明也涉及包含本发明的多核苷酸或其片段或变异体的载体，以及用本发明的

载体或AOC4或OPR7编码序列经基因工程产生的宿主细胞。[0066] 本发明中，AOC4或OPR7基因可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

[0067] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含AOC4或OPR7基因编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。[0068] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如植物组织培养用的潮霉素、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

[0069] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

[0071] 本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

[0072] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。[0073] 用途

[0074] 本发明人发现，AOC4或OPR7基因在植物体内发挥着重要的作用，大量表达将导致植物对昆虫的杀灭性。基于以上新发现，本发明的AOC4或OPR7蛋白或其编码基因有着多方面多用途，包括但不限于：用于抑制昆虫；用于制备具有抗虫性的植物(转基因植物)；用于作为判断植物抵抗昆虫能力的分子标记。因此，基于该目标基因，可设计出多种转基因载体，例如设计大量表达或定时表达或诱导表达的转基因植物，从而在不影响产量的情况下，提高植物的抗虫性。[0075] 转基因植物

[0076] 本发明还涉及一种提高植物抗虫能力的方法，该方法包括将编码本发明AOC4或OPR7蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸转入植物中，从而使得所述植物具有更优良的抗虫能力。

[0077] 作为本发明的一种优选方式，将编码本发明AOC4或OPR7蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸转入植物中的方法如下：[0078] (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有AOC4或OPR7蛋白的DNA编码序列；

[0070] [0079]

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该AOC4或OPR7

蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

9

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说 明 书

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(3)选择出转入所述AOC4或OPR7蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

[0081] (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。[0082] 其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。[0083] 通过所述的提高植物抗虫能力的方法获得的转基因植物及其杂交后代也包括在本发明内。

目前，利用植物作为媒介，通过转入杀虫基因，从而抑制昆虫的生长或杀灭昆虫

已经是本领域人员熟知的技术了，例如Mao Chen等，Insect-Resistant Genetically Modified Rice in China:From Research to Commercialization(ANNUAL REVIEW OF ENTOMOLOGY，2011)中对该种方法的有效性进行了全面的介绍。[0085] 本发明针对有害昆虫如稻飞虱的防治难题，找到了植物自身存在的抗生基因，通过转基因技术或分子标记辅助选择育种技术，可以将该基因转入植物中，实现对昆虫的广谱抗生。本发明的基因具有抗生作用，因此，超表达该基因的植物，可以有效抵御有害昆虫的危害。所述方法方便、快捷、准确且无公害。[0086] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0087] 材料与方法

[0088] 水稻和稻飞虱的种植培养

[00] 实施例中用到的水稻品种有中花11(ZH11)，该品种对稻飞虱表现为中感到中抗(抗性水平5-7级)，主要用于抗虫基因的转基因验证；Rathu Heenati(RHT)，该品种对水稻褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱均表现为高抗(1-3级)，主要用于抗虫基因的克隆；Taichung Native1(TN1)，该品种中没有抗性基因，对稻飞虱非常敏感，主要用于稻飞虱种群的繁殖和饲养。实施例中所用的稻飞虱采自上海松江五厍农场，然后在水稻品种TN1上进行种群繁殖。所有水稻品种种植在上海植物生理生态研究所的日光温室中，温室中的昼/夜温度为28/22℃，昼/夜光周期为14/10小时，相对湿度70-80%。[0090] 水稻的接虫鉴定、取样及总RNA的提取

[0091] 水稻的抗虫鉴定分苗期接虫鉴定和分蘖期接虫鉴定。幼苗接虫后，分别在0h，2h，4h，8h，12h，18h，24h，36h，48h和72h将水稻茎部剪下，样品在液氮中迅速冷却，并于-70℃保存，每个时间点取三个生物学重复。褐飞虱样品取2-3龄的若虫，然后进行总RNA的提取。采用常规Trizol法提取RNA，常规方法纯化，并用DNA酶进行处理，获得浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8～2.2的总RNA样品。

[0084]

mRNA的分离及cDNA的合成

[0093] 用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后用随机六聚物和Invitrogen的Superscript II reverse transcriptase试剂盒合成cDNA第一链。[0094] 基因扩增及测序

[0095] 利用表1所示的引物，以上述合成的cDNA为模板进行表中所列基因的扩增，将获得的基因片段纯化，连接到pMD18-T载体(Takara公司)中，转化入大肠杆菌Top10菌株，蓝白斑筛选，阳性菌株测序，测试正确后用作dsRNA合成的模板。

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CN 104630260 A[0096] [0097]

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表1.AOC4和OPR7两个基因扩增所用的引物序列

[0098]

用于基因超表达的转基因载体构建及水稻转化

[0100] 将包含AOC4及OPR7开放阅读框架的整个cDNA序列分别连入终载体pCambia1301-35SN中，两基因选取的酶切位点均为KpnI和BamHI。终载体pCambia1301-35SN由pCambia1301在多克隆位点前引入花椰菜病毒启动子35s修饰得到。[0101] 水稻转化：采用本领域常规的方法，详细做法参考Hiei Y等Plant Journal,1994，6(2):271-282。

[0102] 稻飞虱在转基因水稻上的生长速率测试[0103] 取20只褐飞虱2龄若虫，提前称取重量，并将其接于4叶期水稻植株上，接虫7天后全部取出再次称重，计算差值。最终以每头褐飞虱每天增加的体重来对褐飞虱的生长速率进行衡量。

[0104] 稻飞虱在转基因水稻上存活率测试[0105] 取20只褐飞虱2龄若虫，接虫于4叶期水稻植株上，罩上带有纱网窗的透明塑料罩，每天记录各植株上存活的褐飞虱数量。

[0106] 稻飞虱在转基因水稻上的蜜露排泄量测试

[0107] 在直径9厘米的小盆内种植无虫的供试水稻植株，两叶一心期时，罩上顶部开有小圆孔的透明塑料罩，植株基部平铺一塑料片，将定性滤纸置于塑料片上用于接受蜜露，罩内接入饥饿两小时处理的褐飞虱3龄若虫5头，两天后将滤纸取出，用1%的茚三酮溶液处理，60℃烘箱烘干30分钟，滤纸上即出现紫红色斑块，斑块面积代表飞虱排泄量，反映了飞虱在植株上的取食情况。

[0108] 稻螟虫在水稻上的生长及对水稻的影响[0109] 选取二化螟3龄初幼虫1头，接虫于40天大小的去分蘖水稻主茎上，5天后观察表型。

[0110] 实施例1、AOC4基因的克隆及其表达情况分析[0111] 利用水稻全基因组芯片分析技术，本发明人对抗虫水稻品种RHT和感虫水稻品种TN1中抗虫相关基因的差异分析，在水稻的3号染色体上发现了一个在RHT中呈持续高表达的基因AOC4，已经提交GenBank(GenBnak No:JX467697.1；LOC_Os03g32314)。在感虫品种TN1中，当受到稻飞虱危害2小时后，其表达量有所提高，但18小时后，表达量又开始下降，如图1所示。

[0099]

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CN 104630260 A[0112]

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水稻品种RHT中的AOC4基因全长及蛋白序列如下：

[0113] AOC4基因全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)：

[0114] ATGGCCGCCGCCGCCCCCTCGCGAGTCTCCGTCAGGGCCGCGGCGCCCGGGCAAACGGGGGGCTTCGCCAAGATCCGGCCGCAGGTGGTGGTGGCAGCGGCGGCGAGGTCGGCCGGGGTGAGCGGCCGCAGGGCGAGGAGCGTTCGGGCGTCGCTGTTCTCGCCGAAGCCGGCGACGCCCAAGGACGCGAGGCCGGCCAAGGTGCAGGAGATGTTCGTGTACGAGATCAACGAGCGCGACCGCGAGAGCCCCGCCTACCTCCGCCTCAGCGCCAAGCAGACGGAGAACGCCCTCGGCGATCTCGTCCCCTTCACCAACAAGCTGTACAGCGGAAGCCTGGACAAGCGGCTGGGGATCTCGGCGGGGATCTGCATCCTGATCCAGCACGTGCCGGAGCGCAACGGCGACCGCTACGAGGCCATCTACAGCTTCTACTTCGGCGACTACGGCCACATCTCCGTGCAGGGCCCGTACCTGACCTACGAGGAGTCCTACCTCGCCGTCACCGGCGGCTCCGGCGTCTTCGAAGGCGCCTACGGCCAGGTCAAGCTCAACCAGATCGTCTTCCCCTTCAAGATCTTCTACACCTTCTACCTCAAGGGCATCCCCGACCTGCCGCGGGAGCTGCTCTGCACGCCCGTCCCGCCGTCCCCGACCGTCGAGCCAACGCCAGCCGCCAAGGCCACCGAGCCCCACGCCTGCCTCAACAACTTCACCAACTAG[0115] AOC4基因蛋白序列(SEQ ID NO:2)：

[0116] MAAAAPSRVSVRAAAPGQTGGFAKIRPQVVVAAAARSAGVSGRRARSVRASLFSPKPATPKDARPAKVQEMFVYEINERDRESPAYLRLSAKQTENALGDLVPFTNKLYSGSLDKRLGISAGICILIQHVPERNGDRYEAIYSFYFGDYGHISVQGPYLTYEESYLAVTGGSGVFEGAYGQVKLNQIVFPFKIFYTFYLKGIPDLPRELLCTPVPPSPTVEPTPAAKATEPHACLNNFTN

实施例2、AOC4、OPR7基因的代谢通路及其超表达分析

[0118] 通过对AOC4基因参与的代谢通路进行分析，发现它是植物茉莉酸代谢途径中的一个关键基因之一，而且是该代谢通路上倒数第二个关键基因(图2A)。为了进一步明确该基因作用，本发明人又克隆出了该代谢通路上的最后一个关键基因OPR7(Accession No:NM_001068510；LOC_Os08g35740)。

[0119] 水稻OPR7基因全长cDNA序列(SEQ ID NO:3)

[0120] ATGGATCGGCCGCCGCCGGATCAGCAGCGGCAGAAGCAGGCGCCGCTCTTCTCGCCGTACCAGATGCCCCGCTTCCGCCTCAACCACCGGGTGGTGCTGGCGCCGATGACGCGGTGCAGGGCGATCGGCGGGGTGCCCGGCCCGGCGCTGGCGGAGTACTACGCGCAGCGGACCACCCAGGGTGGCCTGCTCATCTCCGAGGGCACCGTCGTCTCGCCCGCTGGCCCGGGGTTTCCTCATGTCCCTGGGATATACAATCAAGAGCAGACTGATGCATGGAAGAAGGTGGTGGATGCTGTTCATGCCAAGGGAGGCATCTTTTTCTGCCAGTTATGGCATGTAGGCAGAGCTTCTCACCAAGTATACCAGCCAAACGGTGCTGCACCAATATCCTCAACTGATAAGCCAATATCAGCAAGATGGAGAATACTGATGCCTGATGGCTCCTATGGCAAGTATCCTAAACCTAGGCGCCTGGCAGCATCGGAAATACCTGAAATTGTCGAACAATATCGTCAAGCCGCCATTAATGCCATTGAAGCAGGTTTTGATGGCATTGAGATCCATGGTGCTCATGGCTATATCATTGATCAATTCCTAAAGGATGGAATCAATGACCGCACTGACGAGTATGGTGGCTCACTTTCCAACCGCTGCCGGTTCCTACTTGAGGTAACTAGGGCTGTGGTTTCTGCCATTGGAGCAGACCGAGTCGCGGTGAGGATATCACCAGCCATTGATCACCTTGACGCCTATGATTCAGACCCCATTAAGCTCGGCATGGCCGTTGTTGAGCGGCTGAATGCTCTCCAGCAGCAGTCAGGGCGGCTCGCCTACCTCCACGTCACGCAGCCACGGTACACCGCCTACGGGCAGACCGAGTCTGGGCAGCATGGCAGTGCCGAGGAGGAGAGCCGCCTGATGCGCACCCTCCGGGGCACGTACCAGGGCACATTCATGTGCAGTGGCGGCTACACGCGGGAGCTTGGGTTGGAAGCAGTGGAGAGCGGCGATGCCGACCTGGTGTCGTACGGGCGGCTCTTCATATCAAACCCGGACCTGGTCGAGCGGTTCAGGCTGAACGCCGGGCTGAACAAGTACGTGCGTAAGACATTCTACACGCCCGATCCTGTCGTGGGTTACACGGACTATCCGTTCCTCGGACAGCCTAAGTCGCGGATGTAA

[0117]

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CN 104630260 A[0121]

说 明 书

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OPR7基因蛋白序列(SEQ ID NO:4)：

[0122] MDRPPPDQQRQKQAPLFSPYQMPRFRLNHRVVLAPMTRCRAIGGVPGPALAEYYAQRTTQGGLLISEGTVVSPAGPGFPHVPGIYNQEQTDAWKKVVDAVHAKGGIFFCQLWHVGRASHQVYQPNGAAPISSTDKPISARWRILMPDGSYGKYPKPRRLAASEIPEIVEQYRQAAINAIEAGFDGIEIHGAHGYIIDQFLKDGINDRTDEYGGSLSNRCRFLLEVTRAVVSAIGADRVAVRISPAIDHLDAYDSDPIKLGMAVVERLNALQQQSGRLAYLHVTQPRYTAYGQTESGQHGSAEEESRLMRTLRGTYQGTFMCSGGYTRELGLEAVESGDADLVSYGRLFISNPDLVERFRLNAGLNKYVRKTFYTPDPVVGYTDYPFLGQPKSRM[0123] 将AOC4、OPR7这两个基因分别在ZH11中进行了超表达，均获得了4个超表达株系。AOC4基因4个株系与野生型相比的超表达倍数分别为36，40，53和69倍(图2B)。OPR7基因4个株系与野生型相比的超表达倍数分别为8，12，16和45倍(图2C)。[0124] 根据上述结果，本发明人选取AOC4超表达倍数为36和40的两个株系OE2和OE7进行如下研究，并重新命名为AOC-OE1和AOC-OE2。选取OPR7超表达倍数为45和16的两个株系OE1和OE35进行如下研究，并重新命名为OPR-OE1和OPR-OE2。[0125] 实施例3、AOC4和OPR7基因超表达株系的抗飞虱鉴定结果[0126] 为了确认两个基因分别超表达后对稻飞虱的抗性表现，本发明人分别对两个基因超表达株系进行了苗期和分蘖期的抗虫性鉴定。

苗期的鉴定结果如图3所示：与野生型相比，AOC4基因超表达株系的抗虫明显提

高，但OPR7超表达的株系，其抗虫性与野生型没有明显差异。[0128] 一般的观点认为，水稻在分蘖期的抗虫性可能更能代表这个品种的抗性特点。为此，本发明人又对这两个基因的超表达株系进行了分蘖期的抗虫性鉴定，结果如图4所示。分蘖期的鉴定结果进一步确认：与野生型相比，AOC4基因超表达株系的抗虫明显提高，但OPR7超表达的株系，其抗虫性与野生型没有明显差异。[0129] 实施例4、AOC4和OPR7基因超表达株系对稻飞虱取食量的影响

[0130] 为了检测稻飞虱在AOC4和OPR7基因超表达株系上的生长发育情况，本发明人分别对稻飞虱在两种株系上的取食及生长情况进行了测试。稻飞虱在水稻上的取食情况利用其排泄物，即蜜露量的多少进行判断。[0131] 图5的结果表明，与野生型相比，稻飞虱在AOC4基因超表达株系上的蜜露量显著减少，而稻飞虱在OPR7基因超表达株系上的取食量与野生型没有显著差异。[0132] 实施例5、AOC4和OPR7基因超表达株系对稻飞虱生长发育及存活的影响[0133] 稻飞虱在两个基因超表株系上的生长发育及存活情况见图6。图6A是稻飞虱在超表达株系上取食7天后平均增重情况。与野生型相比，稻飞虱在AOC4基因超表达株系上的生长速率显著减缓，但在OPR7基因超表达株系上的生长也有一定减缓，但与野生型差异不显著(图6A，P<0.01)。图6B显示取食7天后稻飞虱的平均大小。

[0134] 对稻飞虱在两种基因超表达株系上的存活情况测定结果表明，稻飞虱在AOC4基因超表达株系上的存活率显著低于野生型，但在OPR7超表达株系上的存活率与野生型无显著差异(图6C)(P<0.01)。

[0127]

实施例6、AOC4和OPR7基因超表达株系对稻螟虫生长发育的影响

[0136] 对稻螟虫(二化螟)在两种基因超表达株系上的生长情况测试结果表明，稻螟虫在两种基因超表达株系上的生长速率均低于野生型，说明这两个基因的超表达对稻螟虫的

[0135]

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生长发育均有抑制作用(见图7)。

[0137] 图7A是3龄的二化螟在两个基因超表达株系上取食5天的结果，可以看出，两个基因超表达株系对稻螟虫的抗性均有所提高。[0138] 从图7B可以看出，稻螟虫在超表达株系上取食后的生长速率比其在野生型上明显减缓。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独

引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范[0139]

围。

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图1

图2

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图3

图4

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图5

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图6

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图7

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