干细胞生物学论文

[摘要]:小儿脑瘫(CP)是小儿致残率最高的疾病之一，目前国内外尚无一种治愈CP的特效药。由于干细胞具有分化为多种组织器官与自我更新能力等特点，因此，目前研究者集中关注干细胞移植手段治疗小儿脑瘫疾病的研究。本文综述了CP的疗现状与其的病理病因，之后对神经干细胞、骨髓见充质干细胞与脐血间充质干细胞治疗CP的最新进展进行了探讨，以期为利用干细胞移植手段治疗CP奠定一定的理论基础。 [关键词]:干细胞移植 小儿脑瘫

1小儿脑瘫的现状与病理病因

小儿脑性瘫痪(cerebral palsy)，简称脑瘫，通常是指在出生前到出生后一个月内由各种原因引起的非进行性脑损伤或脑发育异常所导致的中枢性运动障碍。该病会导致一系列严重的后果，如姿势与肌张力异常、肌无力、不自主运动和共济失调等特征，并且常伴有感觉、认知、交流、行为等障碍和继发性骨骼肌肉异常，以及智力低下、惊厥等症状，甚至可有癫痫发作。因此，治愈脑瘫患者不仅是医学问题，也是亟待解决的社会问题[1]。

据国内外报道，目前小儿脑瘫痪的发病率约为1.2-2.5 ‰（每千活产儿），尽管近年来已出现许多治疗的办法，但是治愈率很低。我国现有脑瘫患儿400～500万，致残率为42％一45％，并且每年新增小儿脑瘫患者4O万，同时随着围生期医学与新生儿抢救技术的发展以及低体质量儿和早产儿成活率的不断提高，小儿脑瘫的发病率呈不断上升趋势[2]。

小儿脑瘫是小儿神经系统常见病和致残率最高的疾病之一，其病理主要与病理改变与病因及发育中的脑对各种致病因素的易损伤性有关。妊娠早期致病因素主要引起神经元增殖和移行异常，可发生无脑回、巨脑回、多小脑回、脑裂畸形及神经元异位。在早产儿中最常见的病理改变是脑室周围白质软化和脑室周围出血性梗塞。足月儿中的病理类型复杂多样，常与缺氧缺血性脑损伤有关。大理石状态则是在基底节和丘脑中出现神经元丢失和神经胶质增生，并伴有髓鞘化增加，从而呈现出大理石样纹理，是核黄疸的典型改变，也见于缺氧缺血性脑损伤。总的来讲，各种脑瘫的病因均与大脑缺血缺氧密切相关[3]。

2干细胞移植治疗

近年来，干细胞治疗各种疾病的案例不断被报道。干细胞，是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，它是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能的细胞、组织器官，医学界称其为“万用细胞”。干细胞治疗就是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的[4]。近年来，干细胞移植在急性心肌梗死治疗、神经疾病、血液系统疾病以及糖尿病等多种高度威胁人类生命安全的领域中都具有重要作用。例如在急性心肌梗死治疗方面，干细胞可通过促进心肌细胞、血管生成，减少心律失常的发生，抑制缺血再灌注对心肌的损伤而减轻心肌重构、改善心功能。因此，干细胞治疗是未来发展潜力巨大的一种医疗手段[5]。 3干细胞移植法治疗小儿脑瘫

小儿脑瘫是一种神经系统疾病，其患者的神经系统均受到不同程度的损坏，从而严重地威胁着新生患儿的生活乃至一生，并且这种神经系统疾病不易治愈。研究发现，神经系统由神经元和胶质细胞构成。神经系统的功能单位——神经元，在损伤后不可再生，从而严重影响神经功能。神经胶质细胞在神经系统中也有十分重要的功能，在损伤后可以有一定程度的再生，但多数再生的胶质细胞最后形成胶质瘢痕，失去其正常功能。脑瘫患儿的神经系统在发育的晚期和出生后早期，神经前体细胞会从SVZ、VZ及海马等神经干细胞密集的区域向嗅球、大脑皮层、中脑等特定部位迁移，到达特定目的地在局部微环境和内在基因作用下进一步分化为特定的神经元及周围的少量胶质细胞。因此，脑瘫患儿神经系统神经干细胞和神经前体细胞不可逆损伤的程度最终决定该患儿的病情[6]。

最新研究显示，利用干细胞移植法治疗小儿脑瘫患者具有巨大的潜力。目前，对于小儿脑瘫患者的治疗，国内外医生多采用中西医综合治疗的方法，但是该治疗方法的治愈率很低。近年来，由于细胞移植技术特别是神经干细胞(neural stem cells， NSCs)技术的飞速发展就为治疗此类疾病带来了新希望。利用NSCs进行细胞替代治疗和基因治疗有很好的临床应用前景，它的发现尤其成年哺乳动物脑内NSCs的成功提取培养，将对d,JL脑瘫等新生儿缺血缺氧性脑病的治疗提供重要的理论依据和新的治疗方法。目前，用于治疗小儿脑瘫患者的干细胞主要有神经干细胞、骨髓见充质干细胞(BMSCs) 与脐血间充质干细胞(UC—MSCs)三种[7]。

3.1神经干细胞

19年Anderson等[8]提出神经干细胞(neural stem cells， NSCs)的概念，目前人们普遍认为NSCs是指一类具有自我复制更新能力，高度增殖和多种分化潜能的细胞。研究公认在成年啮齿类动物和成人脑中有2个NSCs群：侧脑室下区(subventricular zone， SVZ)和海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone，SGZ)。神经干细胞治疗小儿脑瘫的也正是源于其具有的自我复制的更新能力与可以分化为多种细胞的潜能。

目前，利用神经干细胞治疗小儿脑瘫患者的案例已有不少，说明该种神经细胞的移植法已经开始逐步完善，进入临床阶段。同时，已有大量学者在对其进行深入的研究。2004年，王彬等人[9]利用无血清培养法从胎龄为10周-12周的人工流产胚胎脑皮分离、鉴定了神经干细胞，并加以扩增后移植进入脑瘴患儿脑内进行治疗。他们采用免疫荧光细胞化学技术检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达，确定合适的受体后将其多点植入胼胝体及受损脑区。结果显示，从皮层分离的细胞群具有连续克隆能力，免疫组化证实其Neatin抗原阳性。移植术后患儿病情相应地也有一定的好转。这一结果说明了从中枢神经系统分离的细胞具有自我更新能力。这种神经干细胞为以脑瘫为代表的某些神经系统疾病的进一步治疗提供了有潜在价值的细胞资源。2007年，金慧玉等人[10]调查了自2005年5月中旬以来，在他们医院儿科门诊就诊的 l000多例脑损伤儿中选取的重度脑瘫患儿31例进行了分析与研究。在对上述患者进行人胎脑神经干细胞移植进行治疗后，他们惊奇地发现该神经干细胞的移植对小儿脑瘫患者的治疗取得了较满意的效果。这也从临床上说明了干细胞移植治疗方法的高效性，这为脑瘫患儿带来了新的希望。同年，栾佐等人[11]检验了人神经干细胞(NSCs)移植治疗脑性瘫痪(CP)合并重度视觉障碍患儿的临床疗效。他们提取了孕11周正常发育人胚胎前脑细胞，经体外培养扩增为人神经干细胞球后，经前囟穿刺注入7例严重视觉障碍CP患儿的脑室。经过一段时间的治疗后，他们发现4例患儿出现视觉功能改善，并伴有闪光视觉诱发电位、功能核磁的改变。他们断定人NSCs移植对部分重度视觉障碍脑瘫患儿有治疗作用，为视觉障碍的脑瘫患儿带来了福音。2011年，付强等人

[12]

研究了针刺和神经干细胞联合治疗对脑瘫幼鼠脑神经细胞形态数目及学习记忆能力

和肢体功能的影响，并探讨了该种治疗效果所可能的机制。他们建立了缺氧缺血性脑损伤性大鼠(HIBD)脑瘫模型，经过严格对小鼠分组后进行了悬调实验、斜坡实验与Y迷宫测试，最后取脑组织进行了免疫组织化学检测。他们发现悬调实验、斜坡实验、y迷宫测试、海马正常神经细胞数目及脑皮质的凋亡指数和海马组织切片检查中，联合移植组与模型组和单纯针刺组相比，差异均有统计学意义(P<0．05)。同时，联合治疗

组比单纯针刺组能更好的提高脑瘫幼鼠的学习记忆能力、改善其肢体功能，在维持其脑神经细胞数目和抑制脑皮质细胞凋亡方面有更好的作用。另外，他们还认为将体外成功培养的NSCs移植到病变脑内将有可能使患儿受损脑组织的结构和功能得以恢复

[13]

。同年，他们还对小儿脑瘫疾病现有的治疗方法以及NSCs移植治疗脑瘫的可行性和

存在问题进行了综述、探讨，最后他们提出神经干细胞是干细胞移植治疗脑瘫患者的理想供体。同年，会[14]、刘玉芬[15]、彭琴[16]与李维[17]等人还系统的对神经干细胞移植治疗脑瘫患儿、脑瘫患儿腰椎穿刺神经干细胞移植、脑瘫患儿鞘内注射神经干细胞、神经干细胞移植治疗长期高热脑瘫患儿等手术的围手术期护理进行了论述，并对手术前心理护理、术中护理、术后护理、康复训练，已经出院指导等方面进行护理总结，这为神经干细胞真正的进入临床治疗奠定了基础。2012年，马丽娜还对脑瘫患儿的神经干细胞立体定向颅内移植手术进行了介绍与报道，使得神经干细胞的研究进一步得以推动。 3.2骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的间充质干细胞，它具有定向或多向分化的潜能，可以分化为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等组织器官。2000年，Woodbury D[18]等人将β-巯基乙醇或二甲基亚枫加入骨髓间充质干细胞中培养时发现，部分骨髓间充质干细胞表达了神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经原丝-M和Tau蛋白；5小时后，被诱导的细胞表达了Ncstin(神经细胞前体细胞的标志)；6天后，Nestin表达消失，而TrkA(一种神经生长因子受体)则在5小时一6天之间持续表达。这提示MSCs诱导后逐渐向成熟的神经细胞转化。经过几年的发展，骨髓间充质干细胞的研究开始不断涌现。到2004年，姜红等人[19]就对骨髓见充质干细胞在神经系统疾病中的应用，他分别讨论了骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化，用以进行细胞治疗、基因治疗方面的潜力。同时还分析了骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)以及缺血性脑血管病等疾病的前景。2010年，王晓东等人

[20]

采用粗大运动功

能评定(GMFM)量表评价了骨髓间充质干细胞移植(BM-MSCs)对脑瘫患儿粗大运动功能的影响。他们通过经头立体定向干细胞移植和腰穿蛛网膜下腔注射干细胞移植对患者进行治疗，然后于移植前及移植后12个月内对患者的粗大运动功能进行评估。结果显示，24例受试者均顺利完成临床研究；其术后1个月、6个月及12个月的GMFM总分及A、B、C功能区得分均较移植前显著提高fP<0.01)；移植后1个月时D、E功能区得分较移植前略有提高，这两个区的得分在移植后半年和1年时与移植前相比均显著提高f均

P<0.05)；移植后半年的GMFM总分较术后1个月时显著提高fP<0.05)。因此，他们推测，BM-MSCs移植治疗脑瘫是安全、有效、可行的，可改善脑瘫患者的大运动功能。2011年，王海峰等人[21]分析了脑瘫患者骨髓间充质干细胞(BMSC)的基本生物学特性，观察其在传代培养过程中的表型和所分泌的因子变化。结果显示，BMSCs培养在第3至第1O代时，CD29、CD44、CD106等表型的表达变化无统计学差异，而CD54的表达变化最大。CD14、CD34、CD45和HLA-DR等细胞表型在各代骨髓间充质干细胞中表达均<5％；NGF、NT3、VCAM、ICAM-1、VEGF、BDNF等细胞因子的浓度变化无统计学差异，PGE 的变化需进一步研究予以确认。这为临床应用提供理论依据。2011年，杜侃等人[22]研究了自体骨髓间充质干细胞移植治疗重度脑性瘫痪儿童的临床疗效。他们对50例重症脑性瘫痪患儿进行骨髓间充质干细胞移植，并比较患儿粗大运动和综合功能的进步程度，随访移植后0、l、3、6、l2个月患儿病情情况。结果表明，50例患儿自体骨髓间充质干细胞培养均得到成功。大部分患儿在移植后3个月左右运动能力得到明显改善，移植前后6个月的综合功能评估从(19．14±9．82)％提高到了(28．49±10．52)％，显著大于移植前(P=0．001)，其中以运动和认知改善明显。粗大运动功能评估总百分比也从(23．80±10．)％上升到了 (2731±11．72)％，这说明自体骨髓间充质干细胞移植对康复治疗效果不佳的重症脑瘫患儿有明显临床改善作用，能够有效促进患儿各功能区的发育。2012年，王亚莉等人[23]利用38例脑瘫患者的治疗情况分了分析不同年龄脑瘫患者骨髓间充质干细胞体外增长速率及细胞的传代时间，他们发现不同的年龄阶段骨髓间充质干细胞的体外增长速率不相同，通过比较分析后他们认为 脑瘫患者自体hMSCs是理想的种子细胞，且<20岁患者的hMSCs培养速度快，生长效率高。同年，杨静等人[24]观察、对比分析了自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脐血间充质干细胞(UCBMSCs)移植治疗小儿脑瘫(CP)的临床疗效。他们发现，术后6个月两组的运动功能较术前均有改善，BMSCs移植组在竖头(14.3％vs 2.7％)、身体居中性 (7．7％125 2．7％)、翻身(6．7％钳0)、双上肢抓握等改善率均显著高于UCBMSCs移植组(P<0．01)。 3.3脐带间充质干细胞

2000年，Erices[25]报道从脐血中分离出两种贴壁细胞，一种为破骨样细胞，一种为成纤维样细胞，后者骨髓来源的MSC表面抗原相同，且不表达造血细胞标志如CD14、CD34，他们认为这种细胞也属于间充质细胞，即称为脐血MSCs。换句话说，脐血间充质干细胞是从脐带血中分离和培养的一种多潜能成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在一定条件下可以分化成为神经元细胞。目前，根据UCB-MSCs的这些特性，应用

UCB-MSCs治疗包括脑瘫等在内的神经系统疾病的基础和临床研究已成为热点，并取得了一定进展。

许多脑瘫的患者均表现出重度的缺血缺氧性脑损伤现象，这是导致新生儿死亡和儿童神经系统伤残的主要原因之一，并且尚缺乏特异有效的治疗方法。UCB-MSCs的研究为新生儿HIE的治疗开辟了一条新的途径。由于脐血间充质干细胞拥有如此惊人的潜力，因此，研究者甚多。2001年，Chen J等人[26]就对脐血干细胞的移植途径进行了研究，他们提出MSCs脑内移植的途径有：①直接注射到病变部位：多见于坐骨神经、脊髓损伤模型中细胞和组织材料的移植；开颅手术的患者可将MSC直接注射到病变部位；②脑内移植：经立体定位仪定位后将 MSC移植于侧脑室，使其随脑脊液到达病变部位，或注射人纹状体、海马等；③腰穿椎管内植：将扩增的MSC移植于蛛网膜下腔，使其随脑脊液到达病变部位；④经静脉移植：MSC经静脉输入，使其通过血脑屏障到达病变部位，此法相对简单，创伤小，危险性低且移植的剂量较颅内直接注射大，可允许更多数量的细胞输入。2002年，Hofstetter CP等人[27]。研究了脐血干细胞移植的时间，研究表明缺血缺氧性脑损伤(H1BD)急性期由于脑内缺血、坏死以及存在氧自由基、溶解酶，不利于MSCs存活。HIBD后期脑内bFGF上调，此时移植可能更利于MSCs存活、增殖。2008年，吴芳等人[28]采用脐血间充质干细胞移植治疗了20例脑性瘫痪患儿，结果表明脐血MSCs移植治疗短期内能有效的改善脑瘫患儿的粗大运动功能，患儿的卧位与翻身、坐位得到改善明显。2010年，Xia等人[29]将分离培养出的MSCs经立体定位注射到新生大鼠HIBD模型左侧皮层，移植7d后，观察到移植细胞能够在脑内存活，主要分布在左侧皮层的。在移植部位周围有少量细胞向纹状体和海马部位迁移。ITINSS评分结果显示1周后移植组新生大鼠的神经功能损害较对照组轻，2周后更明显，说明移植入脑内的人脐血MSCs对新生大鼠H IBD具有较好的修复作用。2010年，张丽欣等人[30]探讨人脐血干细胞临床治疗小儿脑瘫的安全性。在进过脐血干细胞静脉输注及蛛网膜下腔注射治疗的20例脑瘫患儿中，他们比较治疗前后患儿的血常规、肝肾功能、电解质、出凝血时间等一系列指标发现并没有明显差异，这说明脐血干细胞治疗小儿脑瘫的临床应用是安全可行的。2011年，林凌等人[31]对脐血干细胞移植的细胞进行了分析。他们指出移植细胞的种类主要有两种：一是将未诱导或修饰过的脐血MSCs直接移植人体内，利用体内环境的信号诱导分化为合适的细胞；另外一种是移植经过诱导或基因修饰过的脐血MSCs，使其分化为我们所需要的神经细胞后再移植人体内。总的来讲，脐血干细胞移植治疗小儿脑瘫疾病的研究也越来越受到重视。

4展望

几乎每天都有干细胞相关的新治疗报道，无疑干细胞具有治疗人类很多疾病的潜能如衰老、癌症、糖尿病、失明和神经性退化，特别是在小儿脑瘫痪等神经疾病中也可以发挥重要作用。尽管这种方法还没有完全被广泛地应用，但是其具有的有效性、安全性一直深受众多研究者的深信。我相信，利用神经干细胞移植手段治疗小儿脑瘫疾病的未来是一片光明。

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