HPLC测定不同产地灵芝中9种三萜酸
目的：建立HPLC测定灵芝子实体中9种三萜酸的方法。方法：采用Alltima C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.04%甲酸溶液，检测波长254 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温15 ℃。结果：灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C1的线性范围分别为6.81～40.88，6.38～38.25，6.75～40.50，6.38～38.25，5.95～35.65，5.90～35.25，7.00～42.00，6.20～37.15，6.05～36.4 mg·L-1（r=0.999 4，0.999 2，0.999 4，0.999 2，0.999 2，0.994 5，0.999 0，0.999 2，0.998 4），加样回收率分别为102.1%，102.3%，100.6%，103.3%，104.1%，103.2%，96.42%，102.5%，101.5%，RSD为1.5%，0.96%，1.9%，1.3%，1.7%，2.5%，0.62%，2.9%，1.3%。测定了31个不同地区、不同栽培条件下灵芝样品的三萜含量。结论：该方法可行、重复性好，可定量测定灵芝中三萜酸的含量。
标签： HPLC； 灵芝； 三萜酸
灵芝为担子菌纲，多孔菌科（Polyproraceae）灵芝属（Ganoderma）真菌赤芝Ganoderma lucidum和紫芝G.japonicum的干燥子实体。始载于《神农本草经》，具有补中益气、滋外强壮、扶正固本等功效。《中国药典》2000年版开始将赤芝、紫芝收为药用正品。灵芝现在多为栽培品种且大多为赤芝，具有明显生物活性的主要有效成分是三萜类化合物，现已分离得到160多种[1]，马林等[2-6]测定了灵芝中三萜酸总含量，建立了灵芝三萜指纹图谱测定方法。本文建立了高效液相色谱梯度洗脱的方法，并测定了31种不同产地、不同培养基栽培的赤芝子实体中9种三萜酸含量，该方法快速、重复性好，可作为评价灵芝质量的方法。
1 材料
Agilent 1200系统高效液相色谱仪（美国）；Mettler Toledoabs 135-S电子天平（瑞士），超声波清洗器（北京天鹏电子新技术有限公司）。
9种灵芝三萜酸对照品均由本实验室提供，经IR，UV，NMR，MS等光谱鉴定，HPLC分析纯度为98%以上；赤芝G .lucidum药材来源见表1，分别由中国医学科学院药物研究所马林副研究员、广东省微生物分析检测中心于舒宁工程师、中国科学院微生物研究所张小青研究员鉴定；乙腈（美国Fisher公司），水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件
Alltima C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流动相为乙腈-0.04 %甲酸溶液；梯度洗脱条件：0～10 min， 20%～25%乙腈，10～20 min，25%～30%乙腈，20～50 min，30%乙腈，50～65 min，30%～38%，乙腈，65～80 min， 38%乙腈；柱温15 ℃；流速1.0 mL·min-1 ；进样量20 μL；检测波长254 nm。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取灵芝酸C26.80 mg，灵芝酸G 6.37 mg，灵芝烯酸B 6.75 mg，灵芝酸B 6.37 mg，灵芝烯酸A 5.94 mg，灵芝酸A 5.88 mg，赤芝酸A 7.00 mg，灵芝烯酸D 6.19 mg，灵芝酸C1 6.06 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取储备液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得质量浓度分别为54.40，50.96，54.00，50.96，47.52，47.04，56.00，49.52，
48.48 mg·L-1的对照品溶液。
2.3 样品溶液的制备
取灵芝子实体粉末（过2号筛）0.5 g，精密称定，加入甲醇100 mL，加热回流1 h，冷却后过滤，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察 精密吸取质量浓度为50 mg·L-1的对照品溶液0.25，0.50，0.75，1.0，1.5 mL置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μL，注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标进行线性回归，得灵芝酸C2回归方程Y=0.921X-0.285（r=0.999 2），灵芝酸G Y=1.28X-2.15（r=0.999 2），灵芝烯酸B Y=1.90X-12.8（r=0.999 4），灵芝酸B Y=1.24X+1.29（r=0.999 2），灵芝烯酸A Y=2.60X-4.30（r=0.999 2），灵芝酸A Y=1.27X+16.3（r=0.999 5），赤芝酸A Y=1.33X+4.51（r=0.999 0），灵芝烯酸D Y=2.70X-17.1（r=0.999 2），灵芝酸C1 Y=1.16X+8.41（r=0.999 4），表明灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C1分别在0.136～0.818，0.128～0.765，0.135～0.810， 0.128～0.765，0.119～0.713，0.118～0.705， 0.140～0.840，0.124～0.743，0.121～0.728 μg线性关系良好。2.4.2 精密度试验 取样品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，每次进样20 μL，计算灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C1峰面积RSD分别为0.53%，0.%，0.45%，0.48%，0.67%，1.2%，0.53%，0.53%，1.1%，说明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验 取样品溶液，按上述的色谱条件分别在0， 4， 8， 12， 24 h进样，进样量为20 μL，计算灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C1峰面积的RSD分别为0.63%，0.85%，0.62%，0.76%，0.86%，1.3%，0.56%，0.73%，1.2%，说明样品在24 h内稳定。
2.4.4 重复性试验 取段木栽培灵芝粉末6份，按2.3项下方法平行制取样品溶液并测定，灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C1的峰面积的RSD分别为2.2%，0.41%，3.4%，2.1%，3.1%，0.53%，3.3%，0.39%，1.7%，重复性良好。
2.4.5 回收率试验 精密称取已知含量的段木栽培灵芝粉末（新粉碎）250 mg 5份，分别精密加入9种对照品混合溶液1.5 mL，按照样品测定项下方法测定，计算回收率，结果见表2。
2.4.6 样品测定 按2.3项下方法制取样品溶液，在已选定的色谱条件下进样20 μL按外标法定量，分别计算样品中三萜酸的含量，结果见表3。
3 讨论
分别比较了氯仿和甲醇回流提取，结果显示，氯仿提取后，对测定干扰大，故选择甲醇。分别考察加热回流30，60，120 min对灵芝中三萜酸含量的影响，结果表示，60，120 min测定结果一致，故选择回流提取时间为60 min。
国内外灵芝中三萜酸的含量测定有比色法[4]、HPLC[2，6]。HPLC为比较精确的含量测定方法，但由于灵芝三萜对照品的缺乏，国内文章及产品报道多用比色法，且多用齐墩果酸或熊果酸作为对照品，测得总三萜含量很高，与实际含量不符，对读者和消费者易产生误导。有的文章虽用HPLC比较了不同灵芝的三
萜情况，但只是HPLC图谱的比较，未进行含量的测定。本文测定了31个灵芝样品中9种三萜酸的含量，结果显示，同一产地的灵芝由于栽培条件不同，灵芝中三萜酸的含量有较大差异，本文首次报道了灵芝酸A的含量在大多数样品中均最高，含量与栽培条件的相关性大于产地的相关性，本文可为优化栽培条件提供借鉴。
在实验中本文对灵芝孢子粉中的三萜酸含量测定进行了方法学考察，并测定了10批样品，结果9种三萜酸含量均为微量级，而目前文献报道灵芝孢子粉及孢子油中的三萜含量用比色法测定，有的达到20%～30%，与实际含量不符，本实验方法可为灵芝孢子粉质量控制提供参考。
在实验中发现，同一批灵芝子实体，粉碎放置4年后与新粉碎样品同时测定三萜酸含量，结果粉碎放置4年后的样品和新粉碎样品中9种三萜酸总含量分别为0.131 7%和0.262 1%，前者9种三萜酸总含量降低了50%，提示应注意子实体粉碎后的稳定性及保存期限。
对于灵芝同一品种不同栽培生长时间、不同栽培条件、不同培养基质对三萜含量的影响以及采过孢子粉的灵芝子实体和未采过孢子粉的灵芝子实体中三萜含量的变化等工作需进一步研究。
[参考文献]
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[5] 李保明，刘超，王洪庆，等.赤芝中三萜酸HPLC特征图谱的研究[J].药物分析杂志，2009，29（9）：1514.
[6] Wang X M， Yang M， Guan S H，et al. Quantitative determination of six major triterpenoids in Ganoderma lucidum and related species by high performance liquid chromatography [J]. J Pharm Biomed Anal， 2006，41（3）：838.
Determination of nine triterpenoid acids from Ganoderma lucidum of different producting areas by HPLC
LI Bao-ming， GU Hai-feng， LI Ye， LIU Chao， WANG Hong-qing， KANG Jie， WU Chang-hui， CHEN Ruo-yun
（1. Institute of Materia Medica， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Beijing 100050， China；2. Beijing Institute For Drug Control， Beijing 100035， China；
3. Fujian Xianzhilou Biological Science and Technology Co.， Ltd.， Fujian 350002， China）
[Abstract] Objective： To establish an HPLC method for determining nine triterpenes contained in Ganoderma lucidum. Method： Chromatography conditions： Alltima C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was adopted as the chromatographic column， with acetonitrile-0.04% formic acid solution as the mobile phase. The detective wavelength was set at 254 nm， and the column temperature was 15 ℃. Result： The linearities of ganoderic acid C2， ganoderic acid G， ganoderenic acid
B， ganoderic acid B， ganoderenic acid A， ganoderic acid A， lucideric acid A， ganoderenic acid D， and ganoderic acid C1 ranged between 6.81-40.88， 6.38-38.25， 6.75-40.50， 6.38-38.25， 5.95-35.65， 5.90-35.25， 7.00-42.00， 6.20-37.15 and 6.05-36.4 mg·L-1（r=0.999 4，0.999 2，0.999 4，0.999 2，0.999 2，0.994 5，0.999 0，0.999 2 and 0.998 4）. Their recoveries were 102.1%，102.3%，100.6%，103.3%，104.1%，103.2%，96.42%，102.5% and 101.5%， with RSD being 1.5%，0.96%，1.9%，1.3%，1.7%，2.5%，0.62%，2.9% and 1.3%. The content of triterpenes contained in G. lucidum samples from 31 different areas and under different cultivation conditions. Conclusion： The method is so feasible and highly reproducible that it can be used for quantitatie determination of the content of triterpenoid acid contained in G. lucidum.
[Key words] HPLC； Ganoderma lucidum； triterpenoid acid doi：10.4268/cjcmm20122320