动物克隆技术的研究进展

摘要: 动物克隆技术是一种动物的无性繁殖技术，它是将胚胎细胞的核植入未受精的去核细胞中，该卵细胞的胞质可刺激被植入的核在分化，结果重组成一个新的胚细胞（即胚胎），这个重组的胚胎的遗传特征与供核体胚胎或供核动物的遗传特征一致，从而实现动物的无性繁殖。目前制备转基因动物的方法主要有胚胎分割，胚胎细胞核移植，胚胎干细胞核移植，胚胎嵌合，体细胞核移植等。本文通过对当前转基因动物的研究进展做出分析,以探讨当前转基因动物的发展方向和展望未来转基因动物的前景

关键词: 动物克隆; 克隆技术; 研究进展

动物克隆就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。如用未分化的胚胎细胞进行核移植称为胚胎细胞克隆；用已分化的体细胞。科学家们很早就尝试进行动物克隆的研究。1938年，德国胚胎学家Spemann即认为，如果能用细胞核移植的方法，将不同发育阶段的细胞核，转移到除去了核的卵子中，对研究细胞核和细胞质的关系具有重要的意义。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了蛙胚胎核移植，获得成年蛙[1]。 1． 动物克隆技术的研究概况

根据供核体细胞的不同和生物技术的发展，可将动物克隆研究分为三个发展阶段：

1.1 胚胎细胞克隆阶段

胚胎细胞克隆阶段1981年，IIImensee和Hoppe报道他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为供核体，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中，重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫，获得了克隆小鼠，这是在哺乳类第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功，但别的实验室一直无法重复此项实验。1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠，此项工作真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。1986年，英国的Willadsen用绵羊的8－16细胞阶段的胚胎细胞作供体进行核移植，首次应用电融合的方法克隆出一只小羊[2]。此后,其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 1.2同种体细胞克隆阶段

同种体细胞克隆阶段1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞，此项实验的成功说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转恢复全能性。

这是生物技术史上具有划时代意义的重大突破，是克隆技术的一个里程碑，也改写了部分生物学的理论。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎儿成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。1998年7月，日本科学家Dato等用牛的输卵管细胞克隆出了8头小牛。1998年7月，美国夏威夷大学Yanagimachi领导的研究小组获得小鼠卵丘细胞进行克隆再克隆小鼠成功的结果。1999年6月，Yanagimachi的研究小组又利用成年雄性小鼠尾尖的成纤维细胞为供核体细胞成功地克隆出了一只雄性小鼠，这也是第一只供体细胞不是来源于雌性动物被克隆的动物。此后，同种体细胞克隆山羊、猪、猫和兔也都相继诞

生。我国体细胞克隆山羊和克隆牛不论雌的还是雄的也都已获得成功。在同种体细胞克隆研究中。所用供核体细胞为高度分化的体细胞。 1.3异种体细胞克隆阶段

异种体细胞克隆阶段异种体细胞克隆是将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。由于濒危物种的个体数量少，很难提供用于克隆的卵母细胞和受体，这就促使科学家提出了异种克隆的设想。异种克隆研究面临着许多问题，如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。这些问题的探讨有利于充实细胞生物学、发育生物学、生殖生物学、免疫学和信号传导等研究领域的理论。

1999年，我们实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核（遗传生物）日本大耳白兔卵母细胞中成功地构建异种重构胚，体外培养获得孵化囊胚。染色体分析和DNA检测均表明重构囊胚的细胞核来自大熊猫 ，细胞质中含有大熊猫的线粒体DNA。2001年将重构胚移植寄母子宫，获得了着床的重大进展。2002年，不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床，而且还能发育，这是异种克隆大熊猫研究中攻克的最后一个难题中的最新进展。 2000年，Lanza等人从死亡的濒危牛上制备出供核体细胞，移入普通牛卵母细胞，受体最长怀孕至202天流产，但证明所有克隆牛胎儿的基因型均与供体细胞一致。 2001年10月，Lol等将死亡的欧洲盘羊的颗粒细胞移入盘羊的卵母细胞构建异种重构胚，移植受体后获得一头正常的体细胞克隆欧洲盘羊，为频危动物保护提供了重要借鉴。

2.克隆动物的常用制作方法 2.1胚胎分割

胚胎分割在很多国家都认为是“克隆”，但这并不是严格意义上的克隆。将未着床 的早期胚胎用显微手术的方法一分为二，一分为四或更多次地分割后，分别移植给受体 体内让其妊娠产仔。由一枚胚胎可以克隆为两个以上的后代，遗传性能完全一样。目前 用胚胎分割法已克隆出小鼠、家兔。山羊、绵羊、猪、牛和马等。

2.2胚胎细胞核移植

胚胎细胞核移植技术要比胚胎分割技术进了一步。它是用显微手术的方法分离来着 床的早期胚胎细胞，将其单个细胞导入去除染色体的未受精的成熟的卵母细胞，经过电 融合，让该卵母细胞质和导人的胚胎细胞核融合、、发育为胚胎。把该胚胎移植给 受体，让其妊娠产仔[2]。目前知道的胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、 猪。牛和猴子等。 2.3胚胎干细胞核移植

将胚胎或胎儿原始生殖细胞经过抑制分化培养，让其细胞数成倍增多，但细胞不分 化，每个细胞仍具有发育成一个体的能力。把该单个细胞利用以上核移植技术，将其导 入除去染色体的成熟的卵母细胞内克隆胚胎，经移植至受体，妊娠、产仔、产生克隆动 物。 2.4胚胎嵌合

把两枚胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）嵌合，共同发育成为一个胚胎，称为嵌合 胚胎。再将该胚胎移植给受体，妊娠产仔。如该仔畜具有以上两种动物胚胎的细胞则称 之为嵌合体动物。如同类黑鼠和白鼠胚胎细胞嵌合，生下黑白相间的花小鼠。不同种的 绵羊和山羊胚胎细胞嵌合，可生下绵山羊，既有绵羊

的特征，又有山羊的特征。目前嵌 合体动物有小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪和牛等；种间嵌合体动物有大鼠一小鼠嵌合体， 绵羊一山羊嵌合体、马一斑马嵌合体，牛一水牛嵌合体。 2.5体细胞核移植

把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用以上核移植的方法，将其 导人去除染色体的成熟的卵母细胞克隆胚胎，经移植受体，妊娠产仔，克隆出动物。比 如克隆绵羊“多利” [4]。它是从一只成年母绵羊的乳腺中取出一个本身并没有繁殖功能的 普通细胞，将这个细胞的基因分离出来备用；然后，再取出另一只母绵羊的未受精的卵 细胞，将这个卵细胞的基因取出，换上第一只母绵羊乳腺细胞的基因，再将这个基因已 被“调包”的卵细胞放电激活，使其开始像正常的受精卵那样进行细胞；当细胞分 裂进行一定连阶段、胚胎已经形成后，再将这个胚胎植到第三只母绵羊，经过正常的妊 娠后产下“多利”。

3. 动物克隆技术的应用 3.1治疗性克隆

“治疗性克隆”是指通过核移植技术构建来源于病人体细胞的胚胎，待胚胎发育至囊胚阶段后取出内细胞团，在体外培养胚胎干细胞，然后定向诱导胚胎干细胞分化成病人所需要的细胞类型，然后再移植回病人身上；或通过组织工程构建病人所需要的组织或器官，移植给病人，来替代或补充病变或受到损伤的细胞、组织和器官，从而实现对疾病的治疗[3]。例如治疗帕金森氏病和糖尿病等。 3.2拯救濒危的动物物种

克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用。以濒危稀有动物的体细胞为供核细胞进行种间核移植，可以解决对濒危稀有动物卵母细胞成熟不够、卵母细胞数量不足等问题。陈大元等、Lanza等和Vogel在这些领域做出了艰苦卓绝的工作，受到广泛关注。 3.3在畜牧业生产上的应用

利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可大大缩短育种年限，加速动物育种进程。在动物杂种优势利用方面，可增强选育种畜的性状稳定性，提高育种效率[5]。

4. 动物克隆技术存在的问题

1.1 克隆效率太低，克隆动物早衰严重

克隆动物健康问题很多，世界各地的克隆动物流产、夭折、畸形现象都非常严重。核移植总体效率低，一般仅为1%～6%。这可能与供体核移入受体胞质后的重塑有关。供体核发生去甲基化、去乙酰化等多种变化，在核重塑过程中基因表达异常都可能导致克隆效率降低[6]。这说明应进一步明确供核基因组的甲基化和乙酰化与核移植胚胎发育的作用机制。

克隆动物效率低与核移植胚胎细胞内的染色体异常、胚胎细胞凋亡、胚胎早期死亡、流产、胎盘发育异常有关。重组胚胎的形态、发育潜能与胚胎细胞凋亡，囊胚的内细胞团之间，内细胞团同滋养层细胞之间的关系与细胞数量的比例之间关系及发育机制需进一步深入研究。染色体异常与核移植胚胎的妊娠失败和克隆动物的先天性畸形之间的关系尚不清楚。 1.2 端粒问题

在正常生理条件下的体细胞随着次数的增加，端粒会逐渐缩短。克隆羊“多莉”细胞端粒较短，可能影响其寿命。据Shiels等报道克隆羊端粒较同

年羊的短。Tian等报道以牛胎儿成纤维细胞作供体的核移植后代端粒比对照组长。Miyashita[7]等报道克隆个体间端粒长度差异显著。Xu等的研究表明克隆动物端粒长度可以恢复。Lanza等报道体细胞克隆牛实验过程逆转了供体母牛体细胞的老化，端粒长度反而增加，克隆牛寿命延长。Kubota[8]等指出，克隆胚胎流产不是端粒长短造成的。这一系列的研究结果表明，克隆后代端粒长度有差别。端粒长度可能不是造成克隆动物高死亡率的原因。在胚胎发育过程中的端粒机制还有待进一步深入研究。 1.3 重新编程的问题

重新编程的机制不明，缺乏基础理论支撑。有些学者认为卵母细胞内有重编程因子存在，也有学者认为，MPF、(maturation promoting factor)和有丝原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的活性与重编程没有直接关系。重编程程度尚不足以支持着床后胚胎的发育，需进一步探索核移植后重编程对克隆成功的影响因素。

最近的研究表明，重编程可能在核移植后的早期就已经启动，随着胚胎发育逐步深入会造成发育阻断或抑制，对不同阶段胚胎发育所需的最佳环境培养的深入研究有助于阐明重编程机制[9]。研究表明核移植后细胞核激活与早期胚胎原核发育类似，但基因组重新编程的机制详细信息尚不清楚。其中，MPF、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)在基因组重编过程中的作用还需明确。 1.4 基因印迹机理不清

基因印迹(imprinting)是同源染色体上基因表达活性不同的遗传现象。基因印迹现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它与胚胎的生长发育和胎盘功能等都有关系。有研究表明被检测的核移植胚胎基因表达不正常，也有报道核移植胚胎均有几百个非印迹基因表达异常。印迹基因异常表达是造成克隆动物不正常的原因。由此看来，合子前不完全重新编程影响着印迹基因和大多数非印迹基因的表达，从而导致克隆动物异常。基因印迹对核移植后基因组重新编程的影响不明确。基因印迹与动物克隆技术的成功及关系值得深入研究。克隆动物种属及其细胞的差异，不同种属动物的克隆难易不同，其中的原因目前人们还不清楚。 1.5 克隆技术条件有待完善

动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大进展，但该技术目前还很不完善，克隆机理性的相关理论研究还很薄弱[10]。另外，克隆胚胎与正常胚胎发育有何异同；胚胎细胞超显微结构及其功能等；线粒体与核移植胚胎发育的关系；细胞核移植的克隆动物在发育生物学中的一些基础问题，如细胞核质关系、细胞核发育全能性和多能性等，对这些问题的深入研究，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。因此，要提高动物克隆的成功率尚需不懈的努力。

参考文献：

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[3]DuF,GilesJR,FooteRH,etal.Nucleartransferofputativerabbitembryonics

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[4]杨淑艳.动物克隆技术及其研究现状．动物医学进展，2003，24(5)：51 ~54 [5]杨章平，常洪.哺乳动物克隆技术研究进展及其对畜牧业的影响．国外畜牧科技，2001，28(3)：22~25

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[8]Machaty Z,Funahashi H,Mayes MA et al.Effect of injecting calcium chloride into in vitro matured porine oocytes,Bio Reprod,1996，54：316 [9] 程乐平 景乃禾.动物克隆技术的研究进展[J].生命的化学,2002.247-361. [10] Wakayama, T., et al., Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 1998, 394: 369 -- 374.