doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2019.22.001
·基础免疫学·
哮喘小鼠中髓样抑制细胞及Arg鄄1、iNOs的表达淤
余孟珠于摇李摇莉盂摇薛摇菲于摇单文琪于摇吕剑平摇汪雪峰盂摇(江苏大学附属医院儿科,镇江212001)
摇摇中图分类号摇R392郾8摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2019)22鄄26鄄05
(Arg鄄1)和诱导性一氧化氮合酶(iNOs)的表达水平。方法:将6~8周清洁级BALB/c雄性小鼠随机分为对照组(control)和哮喘组(OVA),给予哮喘组OVA致敏和激发,建立哮喘小鼠模型,用PBS代替OVA给予对照组。最后1次激发后24h内检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及细胞分类计数;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中抗卵清蛋白(OVA)特异性IgE水平;小鼠肺组织HE染色,光镜下观察病理变化;流式细胞术检测小鼠脾细胞中MDSCs两个亚群所占有核细胞比例;用荧光定量PCR(qRT鄄PCR)技术检测小鼠脾细胞及肺组织中MDSCs产物Arg鄄1、iNOsmRNA的表达水平;用Westernblot方法检测小鼠肺组织中MDSCs产物Arg鄄1、iNOs蛋白表达。结果:哮喘组小鼠肺部可见明显的炎性细胞浸润,与对照组相比,哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比及血清抗OVA特异性IgE明显增高(P<0郾05);哮喘组小鼠脾细胞中G鄄1mRNA表达均增加(P<0郾05),而iNOsmRNA表达均减少(P<0郾05);哮喘组小鼠肺组织中Arg鄄1蛋白表达增加(P<与哮喘的发病。
[关键词]摇哮喘;髓样抑制细胞;Arg鄄1;iNOs
MDSC亚群细胞所占比例明显升高(P<0郾001),而M鄄MDSC亚群无明显变化(P>0郾05);哮喘组小鼠脾细胞及肺组织中Arg鄄0郾05),而iNOs蛋白表达减少(P<0郾05)。结论:哮喘组小鼠中的MDSCs,尤其是G鄄MDSC可能通过产生高水平的Arg鄄1参
[摘摇要]摇目的:探讨哮喘小鼠脾细胞中髓样抑制细胞(MDSCs)两个亚群所占有核细胞比例,以及在小鼠中精氨酸酶鄄1
ExpressionofMDSCs,Arg鄄1andiNOsinasthmaticmice
YUMeng鄄Zhu,LILi,XUEFei,SHANWen鄄Qi,L譈Jian鄄Ping,WANGXue鄄Feng郾DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China
mice郾Methods:BALB/cmicewererandomlydividedintocontrolandOVAgroups,miceintheOVAgroupweresensitizedandchallengedwithOVA,whilemiceinthecontrolgroupwithPBSreplacedOVA郾Within24hoursafterthefinalOVAchallenge,wetestedthenumberoftotalcellsandtheeosinophils(EOS)countsinbronchoalveolarlavagefluid(BALF)bylightmicroscopy郾TheaccumulationofAnti鄄OVA鄄specificIgEinserumofmicewasmeasuredbyELISA郾Theseverityofinflammationinlungtissuewasevaluatedbyhematoxylinandeosin(HE)staining郾ThepercentageofMDSCswereanalyzedbyflowcytometry郾TheexpressionlevelsofArg鄄1andiNOsmRNAweredeterminedbyquantitativeRealtimepolymerasechainreaction(qRT鄄PCR)郾Theproteinexpressionlevelssignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup郾TheaccumulationofAnti鄄OVA鄄specificIgEinserumofOVAgroupwashigherthanthatincontrolgroup(P<0郾05)郾ThespleencellsofOVAgroupshowedahigherpercentageofG鄄MDSCcomparedwithcontrolgroup(P [Abstract]摇Objective:Todetectedtheexpressionofmyeloid鄄derivedsuppressorcells(MDSCs),Arg鄄1andiNOsinasthmatic ofArg鄄1andiNOsweredetectedbyWesternblot郾Results:WefoundthattheinflammationoflungtissueinOVAgroupwasmoresignificantthanthatincontrolgroup郾ThenumberoftotalcellsandtheproportionofeosinophilsinBALFofOVAgroupwere0郾001),but,forthepercentageofM鄄MDSC,therewasnosignificantchangeinthetwogroups(P>0郾05)郾Bothinlungtissueandinthe spleencells,theexpressionlevelsofArg鄄1mRNAfromOVAgroupwasincreasedsignificantlycomparedwithcontrolgroup(P<0郾05),creased(P<0郾05),andexpressionofiNOsproteinwasdecreased(P<0郾05)郾Conclusion:MDSCsinasthmaticmice,especiallyG鄄 作者简介:余孟珠,女,在读硕士,主要从事儿童哮喘的临床与基础方面的研究,E鄄mail:1037038505@qq.com。 通讯作者及指导教师:吕剑平,男,硕士,主任医师,主要从事儿童呼吸系统疾病临床与基础方面的研究,E鄄mail:jdfyljp@163.com。 汪雪峰,女,博士,研究员,主要从事炎症的免疫调节与机制研究,E鄄mail:xuefengwang@ujs.edu.cn。 ·2690·中国免疫学杂志2019年第35卷 [Keywords]摇Asthma;Myeloid鄄derivedsuppressorcells(MDSCs);Arg鄄1;iNOs 摇摇支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,严重危害儿童身心健康。其发病机制尚不十分清楚,但细胞因子在该炎症中所起的重要作用已受到国内外学者越来越多关注。髓样抑制细胞(Myeloidderivedsuppressorcells,MDSCs)是20世纪80年代在肿瘤患者体内发现一群异质性细胞群,源自骨髓祖细胞及未成熟髓细胞,具有强大的免疫调节功能[1,2]。MDSC),表达CD11b+Ly6G-Ly6Chigh表型,另一类为++MDSCs分两个亚群,一类为单核细胞样MDSC(M鄄 1郾2摇方法 美国ABclonal公司。 1郾2郾1摇哮喘模型建立摇分别于第1、8和15天,哮喘组小鼠给予腹腔内注射抗原混合溶液0郾2ml(含OVA50滋g、10%氢氧化铝),对照组给予腹腔注射0郾2ml。第22天开始,哮喘组小鼠每日雾化吸入2%磷酸缓冲盐溶液(Phosphatebuffersaline,PBS)OVA进行哮喘激发,每次30min,每日1次,持续至第28天,共计7d。对照组小鼠给予PBS雾化粒细Ly6C胞样MDSC(G鄄MDSC),表达CD11blow表型[3]Ly6G发展中扮演重要角色。随着深入研究,而且在病毒感染,MDSCs、不仅在肿瘤败血症及自身免疫系统疾病中也起着重要作用[4]研究发现,MDSCs在肺部过敏性炎症中也有高表。国内外有达,同时参与哮喘肺部炎症、气道高反应及气道重塑发生发展[5,6]平的免疫抑制因子发挥免疫作用。研究表明,MDSCs可通过表达高水((Arginase鄄1,induciblenitricoxideArg鄄1)和synthase,诱导性,如:精氨酸酶鄄1iNOs)一氧等化[7]。氮目合前酶MDSCs, 确。本文通过分析哮喘小鼠脾细胞中在哮喘病情进展中发挥作用的机理尚不明MDSCs两个亚群所占有核细胞比例iNOs发生发展中的可能作用机制在小鼠中表达水平,,以及初步探讨MDSCs。 MDSCs产物在哮喘Arg鄄1、1摇材料与方法 1郾1摇材料 1郾1郾1摇研究对象摇选择6~8周龄雄性BALB/c小鼠SCXK(,扬州大学动物研究中心购买照组(control)苏)2017鄄0007],[动物合格证号:和哮喘组实验中所用小鼠随机分为对(OVA)进行造模,每组20只,所有小鼠均在江苏大学实验动物中心SPF级环境中饲养。 1郾1郾2摇主要试剂摇卵清蛋白(OVA,V级)购自美国Sigma公司;goatanti鄄mouseIgE购自美国Abcam公司;HRP鄄conjugatedrabbitanti鄄goatsecondaryIgE购CD11b、PE自中国购自美国Biolegendanti鄄mouseMultisciences公司Ly鄄6C、公;逆转录试剂盒购自日本APC司;FITCanti鄄mouseanti鄄mouseLy6GTaKaRa公司;荧光定量PCR试剂盒All鄄in鄄oneTM购自美国Genecopoeia公司;NOS2Polycional MixAntibody、PolycionalAntibody、HRPARG1 Polycional GoatAnti鄄RabbitAntibody、IgGGAPDH 购自 替代。 1郾2郾2摇支气管肺泡灌洗液收集摇结扎左主支气管后,取预冷的PBS缓冲液1ml,分3次缓慢冲洗右肺fluid,BALF),,收集支气管肺泡灌洗液成后离心取细胞沉渣涂片裂解红细胞后进行细胞计数(Bronchoalveolarlavage,瑞氏染色后计数嗜酸细,计数完胞(Eosnophils,EOS)百分比。1郾2郾3摇血清OVA特异性抗体IgE检测摇取小鼠眼15球血约min取上层血清1ml,室温静置体IgE水。采用30min平,在ELISA后,3450法检测血清000r/min,nm处测吸光OVA离心(OD)特异性值。 抗度1郾2郾4摇肺组织病理评分摇取小鼠左肺组织切片进行HE染色,光镜下进行观察。参考文献[8]对病理1郾组织切片进行炎症评分2郾5摇PBMC的提取及。 MDSCs细胞检测摇小鼠麻醉处死Stanning后单个核细胞buffer(,仰卧,将得到的脾细胞悬液离心弃上清含位2%固胎牛血清的定,暴露腹PBS腔取溶液脾脏)研磨成,加入1,加入液ml,静置buffer3min,重悬细胞后充解红细胞,每管加入,离心弃上清12ml红细胞裂解,洗一遍后进行过滤,再次离心弃上清,用buffer洗一遍,重悬后计数。取每管106个细胞加入100滋lbuffer混mouse匀,分Ly鄄6C别加及入APCFITCanti鄄mouseanti鄄mouseLy6G,4益CD11b、避光染色PEanti鄄30匀min,加入buffer洗2遍,加入400滋l的buffer混1郾2郾,用流式细胞仪检测6摇qRT鄄PCR检测。 Arg鄄1、iNOsmRNA表达摇提取脾细胞及肺组织总All鄄in鄄oneRNA,逆转录得到cDNA,按照TMPCR基因表达进行标准化检测Arg鄄1、iNOs、GAPDH。Mix试剂盒说明书,分别进行实时荧光。引物由美国用GAPDHGenecopoeia对目的公司设iNOs(No郾计合MQP029793)、GAPDH(No郾成,货号如下:Arg鄄1(No郾MQP027158)。MQP026580)、余孟珠等摇哮喘小鼠中髓样抑制细胞及Arg鄄1、iNOs的表达摇第22期·2691· 1郾2郾7摇Westernblot法检测Arg鄄1、iNOs蛋白表达摇提取肺组织蛋白,定量后经SDS鄄PAGE电泳分离,电转移至纤维素膜上,室温下5%脱脂奶粉封闭,将配置好的一抗(用1%BSA以1颐1000稀释)分别4益过夜,TBST洗涤3次,加入HRP标记的抗兔二抗(以1颐5000稀释),室温孵育2h,TBST洗涤5ProPlus6郾0软件进行蛋白条带的半定量分析。倒入孵育盒,将封闭后用TBST清洗后放入一抗中, 窄,肺泡间隔增厚,支气管及血管周围炎症细胞浸润明显。炎症评分较对照组明显增高(P<0郾05),见2郾4摇两组小鼠脾细胞中MDSCs两个亚群占有核细胞比例摇流式细胞术检测两组小鼠脾细胞中MDSCs两个亚群占有核细胞比例,如图4所示,哮喘组小鼠脾细胞中G鄄MDSC亚群细胞所占比例明显高于对照组(P<0郾001),而两组间M鄄MDSC亚群无明显差别(P>0郾05)。图3。 次,加入ECL发光液作用后曝光,最后采用Image鄄1郾3摇统计学处理摇采用GraphPadPrism5软件进0郾行统计分析05为差异有统计学意义,以非配对t检验分析两组间差异。 ,以P< 2摇结果 2郾1摇两组小鼠BALF细胞计数和EOS百分比结果比较摇结果如图1所示,哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比显著高于对2郾照组2摇(两组小鼠血清P均<0郾05)。 OVA特异性抗体IgE水平结果比较OVA摇特异性抗体如图2所示IgE,与对照组相比表达水平明显增高,哮喘组小鼠血清2郾3摇两组小鼠肺组织病理结果比较摇(P与对照组<0郾05)。 相比,哮喘组小鼠肺组织支气管管壁增厚,管腔狭图1摇BALF细胞计数和EOS百分比 Fig.1摇Numberoftotalcellsandproportionofeosinophils inBALF Note:x依s郾n=20郾***郾P<0郾001郾 图2摇血清OVA特异性抗体IgE水平 Fig.2摇LevelofAnti鄄OVA鄄specificIgEinserumofmice Note:x依s郾n=20郾**郾P<0郾01郾 图3摇肺组织病理切片结果 Fig.3摇Pathologicalsectionoflungtissueandinflamma鄄 tionscore Note:x依s郾n=20郾*郾P<0郾05郾 图4摇流式细胞术检测脾细胞中MDSCs细胞比例 Fig.4摇PercentageofMDSCswereanalyzedbyflowcy鄄 tometry Note:x依s郾n=20郾***郾P<0郾001郾 ·2692·中国免疫学杂志2019年第35卷 2郾5摇两组小鼠脾细胞中Arg鄄1、iNOsmRNA表达水平摇采用qRT鄄PCR检测Arg鄄1、iNOsmRNA的表达,结果如图5所示,与对照组相比,哮喘组小鼠脾细胞中Arg鄄1mRNA的表达水平明显升高(P<0郾01);2郾6摇两组小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOsmRNA表达摇采用qRT鄄PCR检测小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOsmRNAiNOsmRNA的表达明显降低(P<0郾001)。 的表达,结果如图6所示,与对照组相比,哮喘组小鼠肺组织中Arg鄄1mRNA的表达水平明显升高(P<2郾7摇两组小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOs蛋白表达摇采用Westernblot法检测小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOs蛋白水平的表达,结果如图7所示,与对照组相比,哮喘组小鼠肺组织中Arg鄄1蛋白水平表达水平明显升0郾001),iNOsmRNA的表达明显降低(P<0郾001)。 图5摇小鼠脾细胞中Arg鄄1、iNOsmRNA的表达 Fig.5摇ExpressionofArg鄄1andiNOsmRNAinspleen ofmice Note:x依s郾n=20郾**郾P<0郾01,***郾P<0郾001郾 图6摇小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOsmRNA的表达Fig.6摇 ExpressionofArg鄄1andiNOsmRNAinlungofmice Note:x依s郾n=20郾***郾P<0郾001郾 图7摇小鼠肺组织中Arg鄄1、iNOs蛋白表达水平Fig.7摇 ProteinexpressionofArg鄄1andiNOsinlungofmice Note:x依s郾n=20郾***郾P<0郾001郾 高(P<0郾001),iNOs蛋白的表达明显降低(P3摇0郾001)。 <讨论 支气管哮喘是全世界范围内儿童最常见的慢性下呼吸道疾病。本研究中,哮喘组小鼠经OVA致敏及雾化激发后,呈现出明显的头面部瘙痒、安静少 动、弓背、前肢抬起、大小便失禁等哮喘急性发作的表现,其BALF中细胞总数、EOS百分比及血清OVA特异性抗体IgE表达水平与对照组相比明显增高,肺组织病理切片HE染色显示,支气管管壁增厚,管腔狭窄,腔内可见大量的黏液,支气管及血管周围可见大量炎性细胞浸润,符合哮喘的病理改变,提示哮喘模型制备成功与肿瘤的发生MDSCs是骨髓来源的一群异质性细胞。 、转移和增殖,而且在病毒感染,不仅参 、败血症、急慢性非特异性炎症、哮喘、创伤以及其他自身免疫疾病中起重要作用。支气管哮喘是一种以多种 细胞浸润和气道高反应为特征的慢性气道炎症性疾病,目前已知与Th1/Th2、Th17/Treg失衡相关[9,10]但其具体发病机制尚未完全清楚。我们前期研究发,现,在反复喘息患儿外周血中MDSCs比例明显升高于肺炎组及正常对照组[11]在哮喘患儿体内表达升高是一致的,这与文献报道[12]MDSCs 发病过程中MDSCs具体作用机制尚不明确,然而。 ,哮喘研究表明,MDSCs可产生高水平的免疫抑制因子Arg鄄1、iNOs和活性氧(ROS),而Arg鄄1和iNOs在抑制T细胞功能方面的作用已被证实[13]将。Arg鄄1NO。L鄄精氨酸转化为酸分解代谢增强MDSCs产生的L鄄,进而从微环境中消耗这种非必需 Arg鄄1鸟氨酸和尿素可活性增加可导致,iNOs可产生L鄄精氨氨基酸L鄄,而L鄄精氨酸与T包括减少精氨酸缺乏抑制TCR信号通路转导障碍等T细胞受体T细胞增殖可通过不同的途径细胞增殖调节密切相关。(TCR)CD3灼链的合成以及 ,[7]。NO与O2-合成具有强氧化能力的过氧亚盐(ONOO-和CD8分子的硝化,从而诱导T细胞的凋亡),可导致。 TCR本研究中两组小鼠脾细胞中MDSCs细胞比例 余孟珠等摇哮喘小鼠中髓样抑制细胞及Arg鄄1、iNOs的表达摇第22期·2693· 2013,34(4):503鄄508郾 结果显示,哮喘组G鄄MDSC与对照组相比明显升高,M鄄MDSC亚群结果比较两组间差异无统计学意义,推测MDSCs在哮喘发展中可能由G鄄MDSC亚群起1、iNOs [14] [6]摇DenJ,ZmijewskiJW,LutherR,etal.Freeradicalproducing oflunginflammationandairwayhyperresponsiveness[J].MucosalImmunol,2011,4(5):503鄄517郾 myeloid鄄derivedregulatorycells:potentactivatorsandsuppressors 主要作用。尽管大多文献报道MDSCs高表达Arg鄄iNOs存在差异,例如,王瑞等[15]发现,与正常小鼠的表达升高,Arg鄄1的表达降低。而我们发现与对照组相比,哮喘组小鼠脾细胞及肺组织中Arg鄄1mRNA表达均升高,iNOsmRNA表达均减少,且在,但也有文献报道MDSCs表达的Arg鄄1、 [7]摇GabrilovichDI,NagarajS郾Myeloid鄄derivedsuppressorcellsas regulatorsoftheimmunesystem[J].NatRevImmunol,2009,9(3):162鄄174郾airway 相比,在胶原诱导关节炎小鼠中MDSCs产物iNOs [8]摇MyouS,LeffAR,MyoS,etal.Blockadeofinflammationand hyperresponsiveness in immune鄄sensitized mice 2003,198(10):1573鄄1582郾 dominant鄄negativephosphoinositide3鄄kinase鄄TAT[J].JExpMed, by 小鼠肺组织中Arg鄄1及iNOs蛋白表达水平与此是一致的。由此推测,不同疾病状态下机体微环境变化可能影响Arg鄄1和iNOs的表达,MDSCs可能通过高表达Arg鄄1参与哮喘小鼠气道炎症反应。也有研究表明,IL鄄4和IL鄄13可诱导产生Arg鄄1,IFN鄄酌可诱导产生iNOs[16]TNF鄄茁,Th2。Th1细胞主要分泌IFN鄄酌、IL鄄12和等,哮喘状态下存在细胞主要分泌Th1/Th2IL鄄4、IL鄄5、IL鄄9失衡,低表达的和IL鄄13Th1细胞因子、高表达的Th2细胞因子是否诱导了Arg鄄1的高表达,抑制了iNOs的低表达,需要进一步实验研究。 MDSC综上所述,本研究结果显示MDSCs尤其是G鄄 过高表达亚群参与哮喘气道炎症反应Arg鄄1、低表达iNOs参与哮喘小鼠气道炎,MDSCs可能通症反应iNOs而为以产物对哮喘发病过程中,需要进一步实验明确MDSCs为靶点的哮喘治疗提供实验依据T细胞反应的影响MDSCs及其Arg鄄1、。 ,从参考文献: [1]摇YoungsuppressorMR,boneNewbymarrowM,cellsWepsicinmiceHT,etal.largeHematopoiesismetastaticlewis and [2]摇lungSamuelcarcinamatumors[J].CancerRes,1987,47(1):100鄄105郾bearingandtotalstrober郾lympoidNaturalirradiation:suppressor(NS)cells,neonataltolerance, [3]摇AnnuYounRevsuppressorJI,NagarajImmol,1984,4(2):219鄄237郾 exploringobscurerelationship[J].cellstumorS,CollazobearingM,miceetal[.SubsetsJ].JImmunol,2008,ofmyeloid鄄derived 181[4]摇(8):5791鄄5802郾 Kaomyeloid鄄derivedJ,KoEC,EisensteinsuppressorS,cellsetal.Targetingimmunesuppressing [5]摇张艳丽Hematol,2011,77(1):12鄄29郾 inoncology[J].CritRevOncolMDSCs、IL鄄10,王秀芳,雷瑞瑞,等(和IL鄄12水平及意义郾哮喘、毛细支气管炎患儿外周血 [J].西安交通大学学报Zhang医学版ofYL,Wang),2013,34(4):503鄄508郾 asthmaMDSCs,IL鄄10XF,LeiorbronchiolitisandIL鄄12RR,[J].inetJthealXi忆peripheral郾AccumulationanJiaotongbloodandsignificanceUnivof(childrenMedSci), with[9]摇HwangviamodulationYH,PaikofMJ,YeeTh1/Th2ST郾equilibriumDiisononyl[phthalateJ].ToxicolinducesLett,2017, asthma [10]摇272:49鄄59郾 单世民机制中的作用研究,毛毅敏,孙瑜霞[J].郾中国现代医学杂志Th17细胞在支气管哮喘小鼠发病 ,2015,25(25):21鄄24郾 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