P57蛋白与HeLa细胞膜结合区的鉴定

张祥;金萌萌;黄鹏;张世谦;张里程;唐佩福

【摘 要】目的 研究肌动蛋白结合蛋白P57的性质、功能及其与细胞膜结合位点.方法 用荧光显微镜观察野生P57蛋白及几种P57缺失突变体蛋白在细胞内的分布.利用细胞吹裂技术检测野生型P57及它的几种缺失突变体蛋白与细胞膜的结合.用差速离心技术分离亚细胞组分,用Western blot检测各组分中蛋白的含量.结果 P57蛋白的386-461片段具有与全长蛋白相类似的细胞分布及细胞膜结合能力,而1-299和1-432片段均不具有此能力.另外过量表达的386-461片段还可以竞争全长蛋白的膜结合位点.结论 P57是由其C末端区域(于386-461片段)负责蛋白与细胞膜的结合.%Objective To study the property and function of P57 protein, and to identify the plasma membrane binding sites with HeLa cell. Methods The distribution of wild-type P57 and its mutants in cells were observed by fluorescence microscopy. The blowing crack technology was used to detect the binding between the wild-type P57 and its mutants with plasma membrane. Differential centrifugation technology was used to prepare subcellular components and the contents of P57 in subcellular components were detected by Western blot. Results It was found that the fragment 386 -461 of P57 has a similar distribution in cells and similar plasma membrane binding abilility as the intact protein, but the fragment 1 -299 or 1-432 hasn't. Overexpression of the fragment 386 -461 can compete with P57 for membrane binding. Conclusion The C-terminal domain containing the fragment 386 -461 is responsible for the binding of P57 to plasma membrane.

【期刊名称】《基础医学与临床》 【年(卷),期】2011(031)003 【总页数】6页(P231-236) 【关键词】P57;细胞膜结合区域

【作 者】张祥;金萌萌;黄鹏;张世谦;张里程;唐佩福

【作者单位】西安医学院附属第一医院骨外一科,陕西,西安,710077;北京大学医学院第一临床医院,内分泌科,北京,100034;中国人民总医院,北京,100853;哈尔滨医科大学附属第一医院,骨外一科,黑龙江,哈尔滨,150001;中国人民总医院,北京,100853;中国人民总医院,北京,100853 【正文语种】中 文 【中图分类】Q73

P57,又名 coronin 1a,TACO,是哺乳动物类冠蛋白(coronin)家族成员之一[1]。其中心区域含有一个 5WD(Trp-Asp)重复序列(5WD repeats),该结构可形成一个螺旋桨状的平台,用于与其他蛋白相结合。C末端的 30个氨基酸残基形成一个亮氨酸拉链结构域(Leucine zipper domain),该结构域可促使 P57蛋白形成同源二聚体[2-3]。目前 P57唯一所知的功能是参与了细胞吞噬作用,研究表明 P57参与吞噬泡的初始形成阶段,当吞噬泡成熟时,P57即从吞噬泡膜上脱离出去[4-5]。然而,P57在该过程中的作用及其具体作用机制尚不清楚。

以往的研究表明,尽管 P57是一种肌动蛋白结合蛋白,然而其与细胞膜之间还存在一种不依赖肌动蛋白的结合方式[6]。本研究检测 P57是否由其 C末端区域负责蛋白

与细胞膜的结合。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

latrunculin B(肌动蛋白抑制酶)(Sigma公司);胎牛血清、RMPI 10培养基(Hyclone公司);增强化学发光试剂盒(ECL kit)(Amersham公司);DMEM培养基、Opti-MEM无血清培养基、lipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen公司);其他试剂均为国产分析纯。细胞培养瓶、细胞培养皿(Greiner公司);小鼠抗 X pressTM单克隆抗体(Invitrogen公司);羊抗 actin多克隆抗体(Santa Cruz公司)。 1.2 细胞培养

实验所用 U937、HeLa以及稳定表达 GFP-P57蛋白的 HeLa细胞系(均为本实验室保存),分别置于含 10%胎牛血清的 RMPI 10培养基及 DMEM培养基中,加入100mg/mL氨苄青霉素和100 mg/mL链霉素,于37℃、5%CO2条件下培养。 1.3 质粒与细胞转染

利用基因克隆技术制备 pEGFP/P57、pEGFP/P571-299、pEGFP/P571-432、pEGFP/P57386-461、pcDNA4.0/P57、pcDNA 4.0/P571-432和 pcDNA 4.0/P57386-461质粒 (图 1)。质粒 pEGFP-c1、pEGFP/P57、pEGFP/P571-299、pEGFP/P571-432和 pEGFP/P57386-461利用质脂体法转染入 HeLa细胞,质粒 pEGFP-c1、pEGFP/P57、 pEGFP/P571-299、 pEGFP/P571-432、 pEGFP/P57386-461、pcDNA 4.0/P57、pcDNA 4.0/P571-432和pcDNA 4.0/P57386-461利用电穿孔技术转染入 U937细胞。为了验证 P57蛋白的 C末端在蛋白与细胞膜结合之间的重要作用,本实验构建了稳定表达GFP-P57的 HeLa细胞系,命名为 L7细胞系,并且利用这种细胞瞬时转染 pcDNA 4.0/P57386-461,观察过量表达的 P57386-461蛋白对 GFP-P57蛋白与细胞膜结合是否存在竞争性抑制作用。

图1 P 57及它的几种缺失突变体示意图Fig 1 Schem atic diagram of P57and its deletion mutants

1.4 P57及其缺失突变体在U937细胞分布的检测

转 染 质 粒 pEGFP-c1、 pEGFP/P57、pEGFP/P571-299、pEGFP/P571-432和 pEGFP/P57386-461的U937细胞转移至放有 0.05%多聚赖氨酸包被后的12mm玻璃盖玻片上,2%多聚甲醛室温下固定,于Nikon Eclipse E800荧光显微镜下观察并用高分辨率 CCD采集图像。 1.5 细胞膜内表面展示

用细胞吹裂技术制备细胞膜内表面[7]。操作如下：U937细胞或 HeLa细胞转移至放有 0.1%多聚赖氨酸包被后的12mm玻璃盖玻片上。Hepes缓冲液 A(mmol/L：Hepes 10,KCl 100,MgCl2 5,EDTA 3,pH 7.0)清洗 3次,并置于 Hepes缓冲液 A稀释液(Hepes缓冲液 A的含量为 20%)中,室温下10min使细胞溶胀。利用50mL的针筒及 22G规格的针头,吸取 Hepes缓冲液 A约 45角度方向迅速吹裂黏附细胞;Hepes缓冲液 A清洗后置于 3%多聚甲醛中室温下固定5min;Hepes缓冲液 A清洗后,样品经 0.3%BSA封闭,加入小鼠抗 X pressTM单克隆抗体,室温下放置1 h,清洗后加入荧光标记二抗,室温下放置0.5 h,清洗后封片处理。利用 Nikon Eclipse E800荧光显微镜观察并用高分辨率 CCD采集图像。药物

Latrunculin B或 DNaseⅠ被用于使细胞膜上的肌动蛋白骨架解聚[8-9],操作如下：U937细胞先用5μmol/L latrunculin B或 2mg/mL DNaseⅠ于37℃处理30min后,再转至玻片上并进行如上操作。

1.6 差速离心分离亚细胞组分及 Western blot分析

差速离心方法被用于分离亚细胞组分[10]。操作如下：latrunculin

B(5μmol/L,30m in)处理和未加 latrunculin B处理(对照组)的重组真核表达质粒pcDNA 4.0/P57、pcDNA 4.0/P571-432和 pcDNA 4.0/P57386-461转染后的

U937细胞(4×107/组)被收集至1.5mL离心管中。细胞经 Hepes缓冲液 B(mmol/L：Hepes 20,pH 7.2,EDTA 1,蔗糖 0.25)清洗两次后,悬浮于1m L 20%的 Hepes缓冲液 B中。之后用 Dounce匀浆器冰浴下匀浆 20次将细胞破碎,取一部分保存设为样品 1(sample 1)。4℃、800×g离心10 min去除细胞核及完整细胞,上清组分于4℃,15 000×g离心10min,沉淀保存设为样品 2(sample 2);上清组分于4℃,100 000×g离心1 h,所得沉淀保存设为样品 3(sample 3)。超速离心后的上清保存设为样品 4(sample 4)。取样品 1、2、3和 4,按不同的稀释比例上样于 SDSPAGE,并分别用兔抗 P57多克隆抗体 (实验室自制)和羊抗 actin多克隆抗体做 Western blot鉴定。 2 结果

2.1 P57及其缺失突变体蛋白在U937细胞内的分布

单独的 GFP蛋白在全细胞内都有分布 (图2A),而 GFP-P57不能进入细胞核内,所以荧光蛋白在细胞内的分布使细胞表现出“露核”的现象(图2B)。在缺失突变体的 GFP融合蛋白中,GFPP571-299和 GFP-P571-432在全细胞内都有分布(图2C,D),而 GFP-P57386-461基本不能进入细胞核内(图 2E),这与 P57全蛋白的分布很相似。

2.2 P57及其缺失突变体蛋白与细胞膜结合情况

在细胞膜内表面暴露后,在内表面可以观察到发出荧光的融合蛋白 GFP-P57与 GFP-P57386-461,在DNaseⅠ处理导致膜上 actin纤维解聚后荧光也没有消失;而融合蛋白 GFP-P571-299和 GFP-P571-432在内膜表面仅有少量存留,并且在 DNaseⅠ处理后荧光也基本消失了(图 3)。

图2 荧光显微镜观察各种 GFP融合蛋白在U 937细胞内的分布Fig 2 The distribution of GFP fusion proteins in U 937 cells was observed by

fluorescencem icroscopy(sca le bar=10μm)A～E.represent respectively cells

transfected with recombinant plasm id pEGFP-c1,pEGFP/P57,pEGFP/P571-299,pEGFP/P571-432 and pEGFP/P57386-461;The corresponding proteins exp ressed in cells are GFP,GFP-P57,GFPP571-299,GFP-P571-432 and GFP-P57386-461 respectively

图3 野生型P57以及它的几种缺失突变体的GFP融合蛋白与细胞膜的结合Fig 3 The binding of GFP fusion form of P 57 and itsmutants to p lasma membrane(scale bar=10μm)HeLa cells were transfected respectively with recombinant plasmid A.pEGFP/P57;B.pEGFP/P571-299;C.pEGFP/P571-432;D.pEGFP/P57386-432;the b lowing crack technology was used to reveal the inner surface of cellmembrane of transfected cells.GFP fusion proteins binding to cellular membrane were observed by fluorescence microscope.Images from groupswith or without DNase I treatmentweremade by high-resolution CCD

在 100 000×g离心得到的膜组分样品 3(框内所示)中可以检测到表达的 P57和 P57386-461蛋白,但是检测不到表达的 P571-432(图 4A,B,C)。而且在

Latrunculin B处理后,100 000×g离心得到的膜组分中仍存在 P57386-461蛋白(图 4 D)。

2.3 P57的 C末端片段可以与全长 P57竞争细胞膜上的结合位点

荧光观察结果表明,在对照组 L7细胞的内表面都可以观察到荧光蛋白 GFP-P57的存在(图 5A),而一些瞬时转染 pcDNA 4.0/P57386-461后的 L7细胞其细胞膜内表面的荧光基本观测不到(图 5B)。 3 讨论

本实验之前的研究表明,P57蛋白与细胞膜之间具有不依赖肌动蛋白方式的结合[6],

本研究进一步利用 P57的几种缺失突变体对P57蛋白上的细胞膜结合部位进行了分析。结果表明,P57蛋白的 386-461片段具有与全长蛋白(1-461)相类似的细胞分布及细胞膜结合能力,而 1-299和 1-432片段都不具有此性质和能力。另外过量表达的 386-461片段还可以竞争全长蛋白的膜结合位点。因此,可以认为存在于蛋白 C端 386-461之间的区域负责与细胞膜结合。

通过序列分析可以知道,P57蛋白的 386-461片段由 C末端的亮氨酸拉链序列区域(432-461)及一段无规序列区域(386-432)组成。从本研究中 1-432片段不具有细胞膜结合能力可以推断出,位于蛋白 432-461段的亮氨酸拉链序列区域对P57蛋白与细胞膜的结合非常重要。已有文献表明,P57蛋白的亮氨酸拉链序列区域负责形成 P57蛋白同源二聚体[2-3],而本研究表明,该区域在此功能之外还可能具有与细胞膜结合的功能。亮氨酸拉链序列区域与细胞膜的关联性在很多研究中都有报道,该区域与细胞膜结合的最主要方式是形成跨膜的亮氨酸拉链结构(membrane-spanning Leucine zipper motif)[11-12],但是对 P57蛋白 C末端序列的疏水性分析表明,它的亮氨酸拉链序列应该不具有跨膜能力。最近报道一种接引蛋白(adaptor)SLP-65的 N末端亮氨酸拉链序列也不具有跨膜能力[13],但是该序列负责蛋白与细胞膜的结合,其具体机制尚不清楚。可以推测,P57蛋白的亮氨酸拉链序列可能具有与 SLP-65蛋白的亮氨酸拉链序列相类似的一种非跨膜的细胞膜结合分子作用机制。

本研究通过对 P57蛋白的细胞膜结合区域的探索研究,为 P57蛋白在细胞吞噬作用中的功能以及与细胞膜相互关系的进一步研究奠定了实验基础。 参考文献：

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