ITS序列分析。

稻属（Oryza）是种子植物门，单子叶植物纲，禾本目，包括20余个野生种。中国是世界上水稻栽培历史最悠久的国家，据浙江余姚河姆渡发掘考证，早在六七千年以前这里就已种植水稻，比泰国还早千余年。目前，我国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有6000～7000年。为重要粮食作物；不仅如此，我国的稻种类型繁多。目前中国收集保存的水稻种植中，来自国内的就占87.84%[1]，其中地方品种占81.26%[1]。在如此众多的品种中，如何区分判断不同稻种之间的亲缘关系，利用更有效的方法研究优良遗传性状，这是水稻资源研究的重要内容之一。

目前人们对植种亲缘关系的研究方法有很多,例如非常成熟的杂交法。从整体上看，遗传多样性的研究方法从个体形态学水平、细胞学水平、生理生化水平发展到了分子水平,研究层次也随之深入。论述了植物遗传变异的来源,总结并分析比较了不同水平的遗传多样性研究方法[12]。进入21世纪现代生物学基因技术飞速发展，从分子水平认识和了解水稻间的亲缘关系成为一种潮流，成为生物学的新的研究领域。在基因方面的研究中，人们发现植物的rDNA中的ITS（internal transcribed spacers）序列有着非常丰富的遗传学信息。分析和研究不同植种的ITS序列，可以通过建立系统树的方法将不同的物种区分开来。在转录单位中，ITS是介于18S和5.8S之间（ITS1）以及5.8S和26S之间（ITS2）的非编码转录区，其转录产物在rRNA的加工过程中被切掉。编码18S、5.8S和26S的序列为高度保守区，ITS序列为进化速度较快的中度保守序列，且个重复单元间具有同步进化的特点。因此利用ITS序列的遗传距离和系统树来探讨系统发育和进化已经得到广泛应用[1]。通过ITS序列分析来研究植种间亲缘关系的方法目前已广泛应用于各种作物，在水稻方面的研究目前还不是很多。

PCR即DNA聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR）。聚合酶链反应是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，参加PCR反应的组分主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，其基本原理如下：加热使双链DNA解开螺旋→在退火温度条件下引物同模板杂交→在Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物→重复上述变性→退火→引物延伸过程至25-40个循环。靶序列被扩增上百万倍，达到体外扩增核酸序列的目的。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增[3]。

所以我们选用分子生物学中的PCR高效扩增技术，大量扩取各个水稻物种的ITS特定序列，经过测序进行进化树的构建来探索不同水稻种得亲缘关系，并可以利用测得的序列对各自的二级结构进行推测。这些研究对于稻属种的保护，进化关系的探索以及栽培稻的改良都具有非常重要的意义。 本研究从分析水稻和三种野生稻的ITS序列入手，利用PCR技术，在完成特定片断测序的基础上，利用软件对其进行序列比对，并对其二级结构进行推测，完成对这些水稻亲缘性关系的科学判断。 2 材料，试剂与仪器 2.1 材料

广陆矮四号稻（Oryza sativa L.subsp.indica）：由湖北省农业科学院曾左癸研究员提供； 药用野生稻（O.officinalis.）由武汉大学遗传所提供；

宽叶野生稻(O. latifolia)，高杆野生稻(O. alta) 由华南理工大学卢永根院士提供。

2.2 主要试剂 50×TAE LB培养基

氨苄青霉素100mg/L IPTG 25mg/ml X-Gal 2.5%，m/v 溴化乙锭(EB)

琼脂糖（Gbico公司） 2.3 仪器

(1)0100-PCR 仪（ MJ Research.INC 公司）

(2)DH4000A 型电热恒温培养箱 （ 天津市泰斯特仪器有限公司 ） (3)JA2003 电子天平 （ 上海精科天平 ）

(4)HYA 恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）

(5)TGL-16G 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂） (6)PHS － 3C 数字酸度计（杭州万达仪器仪表厂）

(7)5417R 冷冻离心机 （ Eppendorf Centrifage ， Germany ） (8) CR22G 高速冷冻离心机 （ 日立公司 ）

(9)DPU 型 Biophotometer DNA&RNA 浓度测定仪 （ Eppendorf Germany ） (10)GeneGenius ＆ GeneGnome 凝胶电泳成像系统（ Synoptics LTD ，UK ） (11)DYY Ⅲ 31C 型电泳槽（北京六一） (12）电泳仪（ BIO-RAD 公司）

(13) Grant 机 （ 意大利 FMTO 公司） (14) 高压灭菌锅 TOMY ss-325 3 实验方法

3.1 基因组DNA的提取

采用CTAB-氯仿分别抽提四种水稻总DNA

（1）取材料稻5g，用无菌水洗涤、吸干、放入液氮冻结

（2）用干冷的研钵，加入预热的20ml ME/CTAB，混合使之充分润湿，于65℃稳浴10~60 min，不时混匀。

（3）用等体积的24：1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使之充分混合，于4℃ （4）10000 rpm 离心5 min，回收上清。

（5）在回收的上清中加入预热的CTAB/Nacl ，20ml氯仿/异戊醇

（6）在4℃ 10000 rpm/min 5min，取上清。加入20ml CTAB 沉淀液，65℃ 30min，4℃ 2700r/min 5min，弃上清。 （7）加入5ml高盐TE溶液，65℃ 30min，重悬，转入10ml离心管 （8）加入3ml异丙醇4℃沉淀2h，4℃ 7500g/min 离心15min。 （9）用80%乙醇洗涤，干燥。30ulTE溶液重悬，-20℃保存。 3.2 PCR扩增反应

根据文献查找，确定扩增ITS1-5.8s rRNA-ITS2序列的特定引物序列[1]：

ITS1: 5’-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3’ ITS4: 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GCT TAA-3’ （1）PCR管内建立10μl 的反应体系： 混匀，加封口膜封口。 （2）按下述步骤进行扩增 ⅰ〉 广陆矮四号稻

1）94℃ 预变性 5min 2）94℃ 变性 30s 3）60.5℃ 退火 30s 4）72℃ 延伸 2min

5）重复（2）---（4）步骤35次； ⅱ〉药用野生稻

1）94℃ 预变性 5min 2）94℃ 变性 30s 3）56.5℃ 退火 30s 4）72℃ 延伸 2min

5）重复（2）---（4）步骤35次； 6）72℃ 延伸10min,4℃保存。 ⅲ〉宽叶野生稻

1）94℃ 预变性 5min 2）94℃ 变性 30s 3）55.2℃ 退火 30s 4）72℃ 延伸 2min

5）重复（2）---（4）步骤35次； 6）72℃ 延伸10min,4℃保存。 ⅳ〉高杆野生稻

1）94℃ 预变性 5min 2）94℃ 变性 30s 3）55.2℃ 退火 30s 4）72℃ 延伸 2min

5）重复（2）---（4）步骤35次； 6）72℃ 延伸10min,4℃保存。 3.3 PCR电泳产物检测 （1）纯化

1）加入0.1体积的3M乙酸钠(PH5.2)和2体积无水乙醇,－20℃沉淀过夜. 2)12000r/min,4℃离心15min,去上清液,在用70％的乙醇洗涤沉淀.

3)12000r/min,4℃离心15min,去上清液,倒置使最后残留的微量乙醇蒸发。 4)用TEbuffer溶解潮湿的DNA沉淀

（2）琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 用40ml的1×TAE配置1.5％琼脂糖凝胶，电压150V， 电泳30min，EB染色后用GeneGenius＆GeneGnome凝胶成象系统观察并拍照 3.4 PCR扩增产物回收

从PCR反应体系中回收PCR扩增产物： 1、照5：1的比例往PCR反应体系中加入PCR Binding Buffer（如50μl PCR反应体系中加入250μl PCR Binding Buffer作为一次标准反应），充分混匀。

2、将吸附柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，12000rpm离心30秒。 3、倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Buffer，12000rpm离心30秒。 4、重复步骤3一次。

5、倒掉收集管中的废液，12000rpm离心2分钟。 3.5 T载体连接反应

1、在微量离心管中配置下列DNA溶液，全量为5μl

2、加入5μl（等量）的Solution I 3、16℃反应30分钟。

4、全量（10μl）加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟 5、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟

6、加入0μlSOC培养基，37℃震荡培养60分钟。

7、在含有X—Gal 、IPTG、Amp的LB—琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。记数白色、蓝色菌落。 8、挑选白色菌落、使用菌落PCR法确认载体中插入片断的长度大小。 3.6 感受态细胞的制备

从-80℃冰箱中取出感受态细胞，冰上解冻，取5μl架到 5mL LB液体培养基中，37℃摇菌过夜。将2管菌液转入100ml含Amp的LB培养基中，37℃摇菌约3h。将培养物分装到2个离心管中，冰浴10min。4000 rpm 离心10min，弃上清，加入2ml预冷的CaCl2吹打混匀。分装后加入甘油，使其浓度为10%。-80℃保存。 3.7 转化反应

1、打开电转化仪调整电压为1300V

2、将感受态细胞转移到预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯，是混合物均匀进入电击杯底部。

3、将电击杯推入电转化仪，按pulse，听到蜂鸣声后，向电击杯加入1000μl的SOC培养基，重悬细胞后转移至1.5ml离心管 4、37℃培养箱中，220~250 rpm 复苏1h。

5、取20μl转化产物加160μl SOC培养基涂板，放于37℃温室培养过夜，次日观察结果。其余菌液加入1：1的30%甘油后混匀，-80℃保存。 注：电击杯清洗流程

1．用清水将电击杯稍冲一下。

2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。 4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。 5．弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 3.8 阳性克隆筛选

1、用接种环挑选白色菌落至1.5ml氨苄青霉素的LB液体培养基，置空气摇床37℃，200 rpm培养过夜 2、用扩增引物进行PCR扩增检测，体系如3.2，35循环

3、扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离检测，确定哪些是成功的转化子。检测成功转化的菌液取一半加甘油至10% -80℃保存，另一半，送出检测。 4 结果分析

4.1 PCR电泳扩增结果： 1. 栽培稻广陆矮四号

经过梯度PCR的得到退火温度在60.5℃的时候扩增带最亮，用60.5℃作为退火温度进行大量扩增，得到电泳结果如图： 2.药用野生稻

用56.5℃、57.2℃、58.0℃、59.1℃、60.2℃、61.2℃作为退火温度进行梯度PCR，发现退火温度在56.5℃的时候扩增带最亮，用60.5℃作为退火温度进行大量扩增，得到电泳结果如图： 3.宽叶野生稻和高秆野生稻

对于宽叶野生稻和高秆野生稻梯度PCR的选择范围是（55.2℃、56.4℃、57.6℃、60.0℃、61.4℃），结果发现退火温度在55.2℃的时候扩增带最亮，用55.2℃作为退火温度对两种野生稻进行大量扩增，得到电泳结果如图：

4.2 ITS序列测序结果分析

(四种稻ITS1、5.8S、ITS2三段序列比对分析) ITS1:

---------------10---------------20----------------30-------------40---------------50

Guangluai4 TCGTGACCCTGACCAAAACAG-ACCGCGAACGCGTCACCCCTGCCCGCCGA O.officinalis TCGTGACCCTAACCAAAA-CATACCGCGAA TGCGTCACCCTTGCCGCCAAG

O. latifolia GTGGACCTGACCAAAACA-GACCGCGAACG CGTCACCCCTGCCGCCGGGGG O. alta CGTGGaCCCGACCAAAACAGACCGC-GAACGCGTCACCCCTGCCGCCGGGG ---------------60---------------70----------------80--------------90--------------100

Guangluai4 GCGCTCGCGCGCGAGGCAACCGA-GGCCCCCGGGCCGCAACAGAACCCACG O.officinalis CGCGGCCAGGCACCGA-GGCCCCCGAGCCG CAACAGAACCCACGGCGTCGA O. latifolia CGGCGGCGGCCGCCGCCGC-CGCGCCCGGC ACCGAGGCCCCCGGGCCGCA A O. alta GCGGCGGCGGCCGCCGCCGCCG-TGCCCGGCACCGAGGCCCCCGGGCCGCA --------------110--------------120---------------130----------------140----------150

Guangluai4 GCGCCGACG G CGTCAAGGA A CACAGCGAT A CGCCCCGCGC C G GCCCGGTC O.officinalis CGGCGTCAA G GAACAAATA G ACACGCCCGT G CCTCCTGGTC G GCCCTGGC O. latifolia CAGAACCCA CGGCGCCGAC GGCGTCAAGG AACACATCGA CACGCCCGCGC O. alta ACAGAACCCACGGCGCCGA CGGC-GTCAAG GAACACATCG ACACGCCCGCG --------------160--------------170-------------180--------------190------------200---

Guangluai4 GGCCCTGGCCGTCCGGCGG CGCGGCGCGA TACCACGAG C TAAATC……………. O.officinalis TGGTCGGCA G CGTGGCGCG A TACCACGAGTTAAT…………………………………

O. latifolia CTCCCGGCC GGCCCTGGCC GGCCGGCGGC GCGGCGCGA T ACCGCGAGCT A AT O. alta CCACCCGGCCGGCCCTGGC CGG-CCGGCGG CGCGGCGCGA TACCACGAGCTAAT 5.8S:

-----185----------------195------------ Guangluai4 ………………………. O.officinalis ….C CACACGACTC O. latifolia ………………………. O. alta ……………………………

--------200----------------210---------------220----------------230-----------------240-- Guangluai4 CCACACGACTCTCG-GCAACGGATATCTCGGCTCT CGCATCGATGAA

O.officinalis TCGG C AATTGATAT C TCTGCTCTC GCATTAATGA A GAATGTAGC G O. latifolia …………....CCACACG ACTCTCG-GCAACGGATATCT CGGCTCTCGC A O. alta …………………CCACACGACTCTC-GGCAACGGATATCTCGGCTCTCGC

-----------------250----------------260----------------270----------------280---------------290 Guangluai4 GAACGTAGCGAAATGCGATAC-CTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACC O.officinalis AAATGCGATACCTAGTGT-GAATTGCAAAATCCCATGAAT CATCGAGTCTT O. latifolia TCGATGAAAAACGTA-GCGAAATGCGATAC CTGGTGTGAA TTGCAGAATCC O. alta ATCGATGAAGAACGTAGCGAA-ATGCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAATC

-----------------300----------------310----------------320----------------330----------------340 Guangluai4 ATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTG-CGCCCGAGGCCATCCGGCCGAGGGCAC O.officinalis TAAACACAA GTTGCGCCCAAGGCCATCCA GTCGAGGGCACGCCTGCCTAG O. latifolia CGTGAACCA TCGAGTCTTTGAAC-GCAAGTTGCGCCCGAGGCCATCCGGCC O. alta CCGTGAACCA TCGAGTCTTTG-AACGCAAGTTGCGCCCGA GGCCATCCGGC ----------------350-----------------360--------------370--------380 Guangluai4 GCCTGCCTGGGC-GTCAC…………….. O.officinalis GCATCA…………………………-………

O. latifolia TCGATGAAAAACGTAGCGA-AATGC… O. alta CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA ITS2：

------350------355--------360--- Guangluai4 ……………………. O.officinalis ACACCAAAAGAT O. latifolia ……………………. O. alta ………………………..

------360-----------------370----------------380-------------------390-----------------400- Guangluai4 ... ACGCCAAAAGACG-CTCCACGCGCCCCCCCTA TCCGGGAGGGCGCG O.officinalis .….GCTCCACCGGC CCCACCCGACCCGGCAGGGGGCGGGGACACG G O. latifolia ………. …..…ACGCC AAAAGA-CGCTCCACGCCCCCCCACCCAACCGG. O. alta ………..………….CGCCAAAA-GACGCTCCACGCCCCCCCACCCGACCC

-----------------410----------------420---------------430-----------------440---------------450 Guangluai4 GGGACGCGGTGTCT-GGCCCCCCGCGCCTCGCGGCGCGGCGGGCCGAAGCT O.officinalis TGTCTGGCCACCCGTGTCG-CGAGGCGCAGCGGACCGAAGCTCGGGTTGCC O. latifolia GAAGGGGGCGGGGAACGCG-GGGTCGGCCCCCCCGCGCCCCGGGGGGCGGG O. alta GGGAGGGGGCGGGGGACGCG－GTGTCTGGCCCCCCGCGTCGCGAGGCGCGG

-----------------460----------------470----------------480-----------------490---------------500 Guangluai4 CGGGCTGCCGGCGAAGCGTG-CCGGGCACAGCGCATGGTGGACAGCTCGCG O.officinalis GGCGAAGCATGCCTGGCACAG-TGCATGGTGGACAGCTCACGCTGGCTCTA O. latifolia GGGACAAACCTCGGGCCGCCG-GCAAACCTTGCCGGCACCAGGGCTGGTGG O. alta CGGGCCGAAGCTCGGGCCGCCGG-CTAAGCGAGCCGGGCACAGTGGATGGT

- ---------------510----------------520----------------530-----------------540---------------550 Guangluai4 CTGGCTCTAGGCCGCAGTG-CACCCCGGCGCGCGGCCGGCGCGATGGCCCC O.officinalis GGTCGCAGTGCACCCCGGCGCG-CAGCCGGCGCGATGGCGCCTCAGGACCC O. latifolia AACGGCACACTCCGCCTCTGGG-CCGGAGGGCCCCCCGGCCCGCGCCCGGC O. alta GTAGGGATC ATGCCGGCTT TAGGTCG-CAG TGCACCCCGG CGCGCCCCCCG

-----------------560----------------570-----------------580-----------------590-------------600 Guangluai4 TCAGGACCCAAACGCAC-CGAGAGCGAACGCCTCGGACC………………….

O.officinalis AGATGCATCAAGGAC-TAGCTCGGACCCCG A CC……….................................. O. latifolia GCGATGACCCCTAAGACCCCAAA-TCCCCCGATGACCGCTTCGAACGGCCC O. alta GCGCT A TGGCCCCA………………-………………………………………………. 5 讨论

5.1 PCR扩增方法及结果讨论

1.引物设计原则：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。一般引物序列中G C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 2.PCR常见问题：

1. 出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 2.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 3.退火温度选择:

退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 5.2 栽培稻于野生稻亲缘关系分析：

根据测序分析结果，利用DNAMAN和BioEdit软件，可以推测出四种稻属的亲缘关系如下图：

由亲缘关系图可以看到稻属在进化过程中DNA发生了一系列的稳定差异。两种稻分子差异的多少决定了他们的亲缘关系的远近。所以由图5可以看出栽培稻广陆矮四号与药用野生稻的关系最为紧密，宽叶野生稻与高杆野生稻的关系比较紧密。这个结果同样支持了，广陆矮四号和药用野生稻同为二倍提稻，而高杆野生稻和宽叶野生稻同为四倍体稻的客观结论。

需要说明的是本研究仅仅从稻种的ITS序列入手，分析分子水平的差异。并不能看出品种间的地理分布和进化规律。只能说明分子水平的亲缘关系远近。

5.3 二级结构预测： 1. 广陆矮四号： 2.药用野生稻： 3宽叶野生稻： 4.高杆野生稻：

根据以上各种稻的ITS二级结构推测图来看，广陆矮四号稻和药用野生稻的二级结构在一定程度上具有一定的相似性，具有四个臂和一定的结构环。宽叶野生稻和高杆野生稻也具有相似的特点。这些可以认为是稻属的保守性在ITS2序列中的具体体现。但是也可以发现具体结构仍然存在较大的差异。这些差异可能是由以下因素引起的：

1、PCR引物的选择： PCR引物的非特异性会造成二级结构的不准确 2、种属自身的特异性：

即：稻种的特异性不仅仅体现在于一级结构，序列的差异，在二 级结构本身也体现一定的差异。空间结构的不同决定了不同的功能，体现不同种属的差异性。

当然，对于不同稻属，一级结构和二级结构两者之中的哪一个在种属差异中起决定作用还有待研究。

注：本研究需要进行多次重复操作实验以保证测序结果的正确性，由于时间的关系，本次设计所完成的实验操作重复次数有限，所以不排除序列本身正确性的影响。就这一点，还需要多次做克隆测序来验证，