东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应

中国农业科学２０１６，４９（２２）：４４０８—４４１８　Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ　Ｓｉｎｉｃａ　ｄｏｉ：１０．３８６４￣．ｉｓｓｎ．０５７８—１７５２．２０１６．２２．０１３　东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应　丁建莉　，姜　昕１，２　７关大伟　，马呜超１，２赵百锁２周宝库３　曹凤明１，２李力　，李俊　（　中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京１０００８１；　农业部微生物产品质量安全风险评估实验室，北京１０００８１　黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨１５００８６）　摘要：【目的】为表征长达３５年轮作与施肥条件下东北黑土微生物群落特征，解析长期施肥及作物对土壤微生　物丰度和群落结构的影响，探讨东北黑土微生物群落变化与施肥及不同作物间的相互关系，为进一步改良耕作制度　与施肥方式提供依据。　【方法】依托黑龙江省农业科学院长期定位试验站，选取玉米和大豆两种作物季的４个不同　施肥处理：不施肥处理（ｃＫ）、有机肥处理（Ｍ）、无机肥处理（ＮＰＫ）和有机肥配施无机肥处理（ＭＮＰＫ）的耕层土壤　为研究对象，处理前加字母ｍ表示玉米季样品，加字母ｓ表示大豆季样品。借助Ｉ１ｌｕｍｉｎａ　Ｍｉ　ｓｅｑ高通量测序平台和　Ｒｅａ１－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术，以１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因为分子标靶，研究作物与施肥方式对黑土中微生物群落结构和丰度的影响，　分析群落变化与土壤化学性质的相关性。【结果】玉米季土壤１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因拷贝数（６．３２　Ｘ　１　０８－８．８３　Ｘ　１　０８／ｎｇ　ＤＮＡ）　比大豆季的低（０．９６　ｘ　１０９－２．３０　Ｘ　１０’／ｒｉｇ　ＤｂｌＡ）；玉米季土壤微生物多样性（ＡＣＥ指数为３　６７４．５８—４　０３４．８４）也　低于大豆季（ＡＣＥ指数为４　１６７．４７—４　８８７．３６）；玉米季的细菌丰度以Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ（２４．４７％一２７．９０％）最高，而　大豆季丰度最高的是Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（２７．７８％一３４．４０％），Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ和Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ丰度在两季作物中差异　明显。同一作物季的有机肥无机肥配施处理的１６ＳｒＲＮＡ基因拷贝数高于无机肥处理，且有机肥配施无机肥处理的微生　物ｏ【多样性指数也比无机肥处理的高（ｓＭＮＰＫ的Ｃｈａｏｌ指数比ｓＮＰＫ高出１１．８９％）；不同施肥处理之间群落组成存在差　异，Ａ１ｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ在ｓＭＮＰＫ和ｓＮＰＫ处理的相对丰度分别比ｓＣＫ增加３．３１％、５．２４％；Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ在　ｓＭＮＰＫ和ｓＮＰＫ处理均比ｓＣＫ处理增加１．７２％和１．２％，二者相对丰度变化大。相关性分析显示，１６ＳｒＲＮＡ基因拷贝数　与土壤硝态氮和速效钾正相关；微生物菌落多样性指数与土壤全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质　密切相关。【结论】东北黑土不同作物季和不同施肥均会影响土壤微生物丰度、ｃｃ多样性和群落结构。有机肥无机肥　配施能够有效改变微生物群落结构，提高微生物的丰度和多样性，并提高土壤ｐＨ，减缓土壤酸化。　关键词：施肥；作物；微生物群落结构；土壤化学性质；高通量测序；黑土　Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｌａｃｋ　Ｓｏｉｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　ｔｏ　Ｌｏｎｇ．Ｔｅｒｍ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒｏｐｓ　ＤＩＮＧ　Ｊｉａｎ—ｌｉ　，　，ＪＩＡＮＧ　Ｘｉｎ　，　，ＧＵＡＮ　Ｄａ—ｗｅｉ　，　，ＭＡ　Ｍｉｎｇ．ｃｈａｏ　，　，ＺＨＡＯ　Ｂａｉ．ｓｕＯ　，ＺＨＯＵ　Ｂａｏ－ｋｕ　，　ＣＡＯ　Ｆｅｎｇ—ｍｉｎｇ　，ＬＩ　Ｌｉ　，ＬＩ　Ｊｕｎ　，　（　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｌａｎｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｏ＇ｉｎｇ　１０００８１；　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＱｕａｌｉｔｙ＆ＳａｆｅｔｙＲｉｓｋＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎ＆ｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊ＇ｉｎｇ１０００８１；　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ　ＳｏｉｌＦｅｒｔｉｌｉｙｔ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｏｕｒｃｅｓ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００８６）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｉ　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ　ｕｎｄｅｒ　ｍｏｒｅ　３５　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｓｅａｓｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ａｎｄ　ｍａｎｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ．Ｂｌｆａｃｋ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　收稿日期：　２０１６－０５．１３；接受日期：２０１６．０９—０６　基金项目：　国家自然科学基金（４１５７３０６６）、国家“９７３”计划（２０１５ＣＢ１５０５０６）、国家“８６３”计划（２０１３ＡＡ１０２８０２—０４）、农业微生物产品质量安全　风险评估专项任务（ＧＪＦＰ２０１６０１３）、国家现代农业产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ．０４）　联系方式：　丁建莉，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｎｄｊｌ＠１２６．ｔｏｍ。通信作者姜听，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｘｉｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ。通信作者李俊，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌ￣ｕｎＯｌ＠ｃａａｓ．ｃｎ　２２期　丁建莉等：东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应　ａｎｄ　ｃｒｏｐｓ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｉｌｌａｇｅ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｍｅｔｈｏｄ］　．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｌｏｎｇ。ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｉｎ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｆｏｕｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎ　ｓｏｙｂｃａｎ　ａｎｄ　ｍａｉｚｅ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ（ＣＫ）；　ｍａｎｕｒｅ（Ｍ）；ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｆＮＰＫ）；ａｎｄ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ　ｗｉｈ　ｍａｎｕｒｔｅ（ＭＮＰＫ）．Ｌｅｔｔｅｒ“ｍ”ｂｅｆｏｒｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｍａｉｚｅ　ｓｅａｓｏｎ　ｓａｍｐｌｅ，ａｎｄ　ｌｅｔｔｅｒ“ｓ”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｓｅａｓｏｎ　ｓａｍｐｌｅＴｈｅ　Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｍｉｓｅｑ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｏｆ　１６Ｓ　．Ａ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｒｏｐｓ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　．ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｏｉｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅ　１６Ｓ　ｒＩ　ＮＡ　ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ　ｒｏｗｉｇｎｇ　ｓｅａｓｏｎ　９６ｘ１０９－２（６．３２ｘ１０ｓ－８．８３ｘ１０Ｓ／ｎｇ　ＤＮＡ）ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｈａｎ　ｔｔｈａｔ　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎ（Ｏ３０ｘ１０　ｇ　ＤＮＡ）．Ａｌｐｈａ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　．．ｍａｉｚｅ　ｒｏｗｉｇｎｇ　ｓｅａｓｏｎ（ＡＣＥ　ｉｎｄｅｘ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　３　６７４．５８—４　０３４．８４）ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｈａｔｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｓｅａｓｏｎ（ＡＣＥ　ｉｎｄｅｘ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　４　１　６７．４７—４　８８７．３６），ｔｏｏ．Ｔｈｅ　ｔｏｐ　ｐｈｙｌｕｍ　ｗａｓ　Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ（２４．４７％－２７．９０％）ｉｎ　ｍａｉｚｅ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎ，ｂｕｔ　ｉｔ　ｗａｓ　Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　（２７．７８％－３４．４０％１　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ．Ｔｈｅ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｎｕｒｅ　ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｔｒｉｌｉｚｅｒｓ．Ａｌｐｈａ　ｄｉｖｅｒｓｉｙ　ｔｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｎｕｒｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｈｔａｎ　ｈｔａｔ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ（Ｃｈａｏｌ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｓＭＮＰＫ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｈｔ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｓＮＰＫ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　１１．８９％）．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｏｎｅ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎ　ｗａｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ　ｏｆ　Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｓＭＮＰＫ　ａｎｄ　ｓＮＰＫ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｓＣＫ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　３．３１％ａｎｄ　５．２４％．Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｆｉａ　ｉｎ　ｓＭＮＰＫ　ａｎｄ　ｓＮＰＫ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　１。７２％ａｎｄ　１．２０％ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｓＣＫ．ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｗａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｈ　ｔｓｏｉｌ　Ｎ０３　Ｎ　ａｎｄ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　Ｋ，ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｙ　ｔｉｎｄｅｘ　ｎｄ　ａｓｏｉｌ　ｔｏｔａｌ　Ｎ，ＮＯ３＂Ｎ，ＮＩ￣＋－Ｎ，ａｖａｉｌａｂｌｅ　Ｐ　ａｎｄ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　Ｋ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ．【Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎ］Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｈａｔｔ　ｏｆｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｓ　ｎｄ　ａｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　ｈａｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｒｉｃｈｎｅｓｓ，０【ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｓｏｉｌ　ｐＨ，ｓｌｏｗｅｄ　ｄｏｗｎ　ｓｏｉｌ　ａｃｉｄｉｉｃａｔｆｉｏｎ，ｃｈａｎｇｅｄ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｒｉｃｈｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｃｔｉｖｉｙ　ｔｏｆ　ｍｉｃｒｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ；ｃｒｏｐ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙ　ｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｓｏｉｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ　０　引言　【研究意义】中国东北黑土带是世界著名的三大　黑土带之一，土壤有机质含量高、养分丰富，是重要　的商品粮基地，对国家粮食供应和安全起着举足轻重　的作用，但长期过量不合理的施肥和耕作，导致了黑　酶活性［９］。粪肥的长期施用会使作物根系分泌物和土　壤中可溶性有机碳含量增加，提高土壤中微生物群落　多样性【加】，显著降低土壤真菌与细菌的比率，改变细　菌和真菌群落结构［１”，长期施用绿肥促进了某些细菌　的生长，从而降低了作物枯萎病的发病率【１　。土壤　微生物不仅受施肥方式的影响，也受作物类型的影　ｒＪｌ￣ｔ”】，蔡艳　Ｈ　报道不施肥条件下粮豆轮作有利于提　高细菌多样性。此外，目前的高通量测序技术可对环　境中所有微生物群落进行研究，获得数据量大，并更　土农田质量日益退化［１］。土壤微生物作为农田生态系　统的重要组成部分，能够对长期肥料累积作用产生敏　感而快速的响应，是评价土壤质量、土壤肥力和作物　生产力的重要指标［　。因此，开展对黑土中微生物群　落结构和丰度的研究，能为进一步揭示土壤微生物与　真实地揭示微生物群落的复杂性和多样性，极大促　进了环境中不可培养微生物以及痕量菌的更深入研　生态环境间的响应机制，以及改进施肥和耕作制度提　供依据。【前人研究进展】研究发现，施肥会改变土　壤微生物学特性，长期施用化肥能显著提高土壤微生　物生物量，并引起群落结构变化［３］，长期施氮肥显著　影响固氮菌、氨氧化菌等氮循环菌群［４】，磷肥的长期　施用能控制一些特异性细菌及真菌的密度，但对褐灰　钙土土壤微生物群落总体的丰富度没有明显影响　】。　施用不同有机肥和氮肥均会引起土壤微生物组成的　究［１５－１６１。Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｍｉｓｅｑ高通量测序可实现多样品的可　变区同时测序，前人应用此方法发现东北黑土长期　施用氮肥导致土壤微生物多样性降低，群落结构改　变【＂】；秦杰等【　］通过此技术初步分析了东北黑土长期　施用不同无机肥条件下，土壤微生物群落结构特征和　组成差异变化，并取得一定进展。【本研究切入点】　由于多年连续施用大量无机肥，尤其是氮肥，造成东　北黑土土壤ｐＨ持续下降，土壤有机质含量下降，　土壤中微生物已由“细菌型”向“真菌型”转变【Ｊ　。　已有的报道显示有机肥能够改善土壤质量、改变土壤　差异［刚，有机肥能够显著改变微生物群落结构及多　样性ｔ　，提高微生物生物量和代谢活性［８１、以及土壤　４４１０　中国农业科学　４９卷　微生物组成［２０－２１】，但其如何影响土壤质量及响应机制　并不清楚。同时除常规施肥等农业措施外，不同作物　及种植制度也会对土壤微生物群落结构产生影响，但　目前这方面报道较少。【拟解决的关键问题】本研究　以黑龙江省农业科学院３５年定位试验站的连续两种　作物种植季的４个不同施肥处理耕层土壤为研究对　象，以１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因为分子标靶，借助Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑ高通量测序平台和定量ＰＣＲ技术，探讨长期施　肥和作物对东北黑土微生物群落结构和丰度的影响，　为农田优化施肥和耕作制度，提高土壤可持续生产力　提供依据。　１材料与方法　１．１试验地概况　试验在黑龙江省农业科学院长期定位试验站进　行，该试验站位于黑龙江省哈尔滨市（４５。４０’Ｎ，　１２６ｏ３５’Ｅ），属于松花江二级阶地，地势平坦，海拔　１５１　ｍ，年均气温３．５℃，无霜期１３５　ｄ，年降水量５３３　ｍｌＴｌ。自１９８０年起，试验按小麦．大豆．玉米顺序轮作，　到２０１４年和２０１５年分别为大豆茬（第３５个生长季，　简称大豆季）和玉米茬（第３６个生长季，简称玉米季）。　本试验设计４个处理：不施肥处理（ＣＫ）；有机肥处　理（Ｍ）；施氮肥、磷肥和钾肥的无机肥处理（ＮＰＫ）；　有机肥配施无机肥处理（ＭＮＰＫ），３次重复。处理　名称前加字母ｍ表示玉米季的样品，如，ｍＣＫ表示　玉米季的不施肥处理；加字母Ｓ表示大豆季的样品，　如ｓＣＫ表示大豆季的不施肥处理。氮、磷、钾肥分别　为尿素、重过磷酸钙、硫酸钾。氮磷钾肥大豆期施用　量为７５　Ｎ　ｈｍ－　，１５０　ｋｇ　Ｐ２０５‘ｈｍ　，７５　Ｋ２０‘ｈｍ一；　小麦期和玉米期施用量为１５０　ｋｇ　Ｎ・ｈｍ－　，７５　ｋｇ　Ｐ２Ｏｓ＂ｈｍ～，７５　ｋｇ　Ｋ２Ｏ・ｈｍ～。有机肥为马粪，施用量　为１８　６００　・ｈｍ～。　１．２样品采集　分别于２０１４年９月和２０１５年９月，取作物收获　季５—２５　ｃｍ的耕层土壤，每个重复小区随机取１０个　点，剔除杂质后混匀作为该处理一个重复的土壤样品。　土壤保存于封口塑料袋中，一部分温室风干研磨并过　０．２　ｍｍ筛，用于测定土壤理化性质；另一部分样品保　存于．８０￣Ｃ冰箱，待微生物群落分析。　１．３试验方法　１．３．１　土壤化学性质测定铵态氮测定采用ＫＣ１浸　提．靛酚蓝比色法【　。参照鲁如坤　。　方法测定以下土壤　化学性质。其中，土壤ｐＨ测定采用酸度计法（土：　水＝１：１）；土壤有机质测定采用浓硫酸．重铬酸钾消　煮．硫酸亚铁滴定法；土壤全氮的测定采用半微量凯氏　定氮法；土壤有效磷的测定采用ＮａＨＣＯ３浸提－钼锑抗　比色法；土壤速效钾的测定采用乙酸铵浸提一原子吸收　火焰光度法。　１．３．２土壤ＤＮＡ的提取和Ｉ６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的高通量测　序土壤总ＤＮＡ使用美国ＭＯＢＩＯ公司的ＰｏｗｅｒＭａｘ　Ｓｏｉｌ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ试剂盒，每个样品称取０．２５　ｇ　土壤，依照试剂盒说明提取土壤总ＤＮＡ。所提取的土　壤总ＤＮＡ的浓度和纯度用核酸定量仪（ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ　１０００）检测。ＤＮＡ送至北京奥维森基因科技有限　公司，应用Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑ平台对细菌和古菌１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的Ｖ４（５１５Ｆ．８０６Ｒ）进行测序【　。测序原　始序列上传至ＮＣＢＩ的ＳＲＡ数据库（ＳＲＰ０６２５１２）。　１．３．３　１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因丰度测定采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ定　量ＰＣＲ法测定１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因，反应在ＡＢＩ　７５００　Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（ＡＢＩ，ＵＳＡ）仪器上进行。反应体系为　ＦａｓｔＦｉｒｅ　ｑＰＣＲＰｒｅＭｉｘ（ＴＩＡＮＧＥＮ，Ｃｈｉｎａ）１０　ｕＬ，ＲＯＸ　ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ０．４　，１　ＤＮＡ模板，１０ｎｍｏｌ・Ｌ。引物　（５１５Ｆ．８０６Ｒ），补加ｄｄＨ２０至２０　。以含有１６Ｓ　ｒＲＮＡ　基因的重组ｐＧＥＭＲ－Ｔ载体为标准质粒，参照文献［２５］　制备质粒和进行后续工作。　１．４数据分析处理　通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑ平台进行Ｐａｉｒｅｄ．ｅｎｄ测序，　下机数据经过ＱＩＩＭＥ（ｖ１．８．０）软件过滤、拼接、去　除嵌合体【＂］，再聚类为用于物种分类的ＯＵＴ　（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｕｎｉｔｓ），ＯＴＵ相似性设置为　９７％。对比Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ数据库，得到每个ＯＴＵ对应　的物种分类信息。利用Ｍｏｔｈｕｒ软件（ｖｅｒｓｉｏｎ　１－３１．２）　进行旺多样分析（包括Ｓｈａｎｎｏｎ、ＡＣＥ和Ｃｈａｏｌ等３　个指数）。基于Ｗｅｉｇｈｔｅｄ　Ｕｎｉｆｒａｃｅ距离［　卅，使用Ｒ　（ｖ３．１．１）软件包的ｐｈｅａｔｍａｐ进行聚类分析【　。采用　ＳＰＳＳ　１９．１软件，单因素ＡＮＯＶＡ分析和Ｐｅａｒｓｏｎ相关　性分析，用Ｔｕｒｋｅｙ显著差异法分析处理间的差异显　著性；同时应用两因素方差分析（Ｔｗｏ．ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）　说明作物效应和施肥效应的显著性。　２　结果　２．１　不同作物和施肥处理对土壤化学性质的影响　两种作物季的不同施肥处理对土壤化学性质影响　见表１，施肥和作物对土壤化学性质影响见表２。单因　素分析结果表明，与不施肥相比，单施无机肥降低了　土壤ｐＨ，施有机肥提高了ｐＨ，大豆季的ｓＮＰＫ处理　２２期　丁建莉等：东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应　４４１１　的土壤ｐＨ比ｓＣＫ降低０．９５，有机肥配施无机肥处理　（ｓＭＮＰＫ）的ｐＨ要高出单施无机肥处理（ｓＮＰＫ）０．４。　有机肥配施无机肥和单施无机肥处理极显著增加土壤　中全氮、硝态氮、有效磷和有机质等的含量（尸＜０．０５），　其中玉米季的ｍＭＮＰＫ处理的有效磷含量较ｍＣＫ处　影响不显著，但两个作物季间的铵态氮含量差异显著；　玉米季的铵态氮含量明显低于大豆季的，ｓＮＰＫ处理　的铵态氮含量为３５．８０　ｍｇ・ｋｇ～，而ｍＮＰＫ的仅为１　１．２６　ｍｇ・ｋｇ～，说明作物季的变化是引起土壤化学性质变化　的重要因素之一。同时，通过施肥和作物对土壤化学　性质影响的方差分析，可知施肥和作物均显著影响土　壤化学性质。　理提高６０．８　１　ｍｇ・ｋｇ一，ｍＮＰＫ处理也较ｍＣＫ处理提高　５７．８１ｍｇ・ｋｇ～。总体上，施肥对不同处理的铵态氮含量　表１　两种作物季不同施肥处理土壤化学性质　Ｔａｂｌｅ　１　Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　表中数据为平均值±标准差；同列数值后不同字母表示处理间差异达显著水平（Ｐ＜Ｏ．０５）。下同　Ｄａｔａ　ａｒｅ　ｘ－４－　Ｖａｌｕｅｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ａ　ｒｏｗ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆ　ａｍｏｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０５　ｌｅｖｅ１．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ　表２施肥和作物对土壤化学性质与微生物多样性指数影响的方差分析　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ　ｓｏｉｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　ａ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　２．２不同作物和施肥处理对黑土中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因丰　度的影响　供试土壤中的１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因丰度测定结果如图　１所示，玉米季土壤中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因拷贝数为６．３２×　１０。一８８３×１０　／ｎｇ　ＤＮＡ，大豆季拷贝数为０．９６￣１０　．－２．３０￣１０　／ｎｇ　ＤＮＡ，表明２种作物季存在显著差异。　８．８３×１０　／ｎｇ　ＤＮＡ，比ｍＣＫ和ｍＮＰＫ处理分别提高　了３９．７２％、３６　６３％；另外，ｍＭ处理也较ｍＣＫ和ｍＮＰＫ　处理分别提高２３．７３％、２０．８６％。在２种作物季中均为　在玉米季中，ｍＭＮＰＫ处理的拷贝数最高，为　４４１２　中国农业科学　４９卷　有机肥无机肥配施的拷贝数最高，无机肥处理和不施　肥处理间没有显著性差异。１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因拷贝数与土　壤化学性质的Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析（表３），结果表明，　２．３不同作物和施肥处理对黑土中微生物　多样。陛　的影响　两种作物季不同施肥处理的微生物　多样性指　数均值统计情况见表４。无论是多样性指数Ｓｈａｎｎｏｎ，　基因拷贝数与土壤硝态氮和速效钾极显著正相关，而　与铵态氮极显著负相关。　困醐　蚕Ｊｓ　＿【　还是丰富度指数ＡＣＥ与Ｃｈａｏｌ均是大豆季高于玉米　一《Ｚ０　Ⅱ，　一×】∞ｂ　昌ｊ岛　口０ｕ　０ｇ　《Ｚ　ＩＪ∞　ｍＣＫ　ｍＭ　ｍＭＮＰＫ　ｍＮＰＫ　ｓＣＫ　ｓＭ　Ｓ￣／ＩＮＰＫ　＇ｓＮＰＫ　处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　小写字母表示玉米季不同处理间差异达显著水平；大写字母表示大豆季不同处理问差异达显著水平（Ｐ＜０．０５）　Ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ａｍｏｎｇ　ｍａｉｚｅ　ｓｅａｓｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ；Ｃａｐｉｔａｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｒｅ　ａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ａｍｏｎｇ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｓｅａｓｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（Ｐ＜Ｏ．０５）　图１　两种作物季不同施肥处理黑土中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因丰度拷贝数　Ｆｉｇ．１　Ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　表３　１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因拷贝数、０【多样性指数与土壤化学性质Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析　Ｔａｂｌｅ　３　Ｐｅａｒｓｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｓａ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　，”，０．０１水平具有显著相关性；　，０．０５水平具有显著相关性　，ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｉｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ａｔｔｈｅ　０．０１ｌｅｖｅｌ；＋．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｉｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ａｔｔｈｅ　００５ｌｅｖｅｌ　．表４两种作物季不同施肥土壤中微生物ａ多样性指数分析　Ｔａｂｌｅ　４　０【‘ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｔｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　２２期　丁建莉等：东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应　４４１３　季，两种作物季具有显著性差异。ＡＣＥ指数玉米季为　３　６７４．５８＿＿４　０３４．８４，而大豆季在４　１６７．４７－－－４　８８７．３６。　通过分析可见作物明显影响土壤微生物　多样性。　大豆季４个处理０【多样性指数比较，单施有机肥　处理（ｓＭ）均最高；有机肥配施无机肥（ｓＭＮＰＫ）　的ＡＣＥ指数和Ｃｈａｏｌ指数高于无机肥处理（ｓＮＰＫ），　（２４．４７％一２７．９０％）、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（１　８．６０％一　２１．４３％）、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ（１２．２３％一１６．９３％）、　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ（７．１　６％一１　０．４９％）和Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ　（４．０７％一６．１４％）。大豆季细菌主要的５个菌门分别　为Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（２７．７８％一３４．４０％）、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ　（１６．３９％一２０．９４％）、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ（８．８５％一　更接近于不施肥处理（ｓＣＫ）。可见长期施肥会引起　土壤微生物ｅｔ多样性的改变。总体上，有机肥配施无　机肥处理０【多样性比无机肥处理高。　通过施肥和作物对土壤微生物多样性指数影响的　１１．０３％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（８．０３％一１０．３４％）和　Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ（７．８０％一８．３７％）。两个作物季的　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ和Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ相对丰度差异明显。　表５中列出了大豆玉米２种作物季不同施肥处理土　方差分析（表２），可知施肥和作物对多样性指数均　有显著影响。进一步分析０【多样性指数与土壤化学性　质Ｐｅａｒｓｏｎ相关性（表３），从表中数据可知０【多样性　指数与土壤全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾　等具有相关性。Ｓｈａｎｎｏｎ指数与全氮含量具有极显著负　相关性，与铵态氮和速效钾含量具有极显著正相关性。　２．４　不同作物和施肥处理对黑土中微生物组成的　影响　壤中微生物纲水平的组成。从表中可知，Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ　在两种作物季中出现较大变化；Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ在　玉米季相对丰度为１２．０１％一１８．５５％，而大豆季为　４．２５％—９．３７％，玉米季的比大豆季所占的比例提高了　７．７６％一９．１８％。另外，Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ在同一作物　季的施肥处理相对丰度要低于不施肥处理，如ｍＭ　（１６．０２％）、ｍＭＮＰＫ（１３．４８％）和ｒｎＮＰＫ（１２．０１％）　的相对丰度均小于ｍＣＫ（１８．５５％）的相对丰度。通　过微生物组成与土壤化学性质Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析　（表６），可知Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ相对丰度与土壤ｐＨ极　显著正相关；与铵态氮、有效磷和速效钾含量极显　著负相关。　供试土壤中的Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ在大豆玉米两种作物　季中变化也较大（表５），其中，Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　经高通量测序分析可知，玉米季有８８．５３　ｃ　一　９１．３７％为细菌，古菌比例为７．５３％一１１．６２％，另外的　１．０９％一１．１７％为不可确定；大豆季有９３．９１％一９６．７１％　为细菌，古菌仅占２．７０％—４．１０％，有０．３２％一２．１８％　不能确定。且两种作物季的古菌中均约９９％以上为　Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ，细菌群落对不同作物季的响应更为显　著。两种作物季的不同施肥土壤中微生物门水平组成见　图２，玉米季细菌主要的５个菌门分别为Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ　和Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ的相对丰度在玉米季分别为　５．０４ｏ／　＿１６．３８％￥Ｉ１　３．７４％—　．２１％；而在大豆季两者分别为　口Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ　圜Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ　■Ｐｌａｎｅｔｏｍｙｃｅｔｅｓ　■Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ　圈Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ　口Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ　墨Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ　■Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ　曰Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｃｒｉａ　圈Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｍＣＫ　ｍＭ　ｍＭＮＰＫ　ｍＮＰＫ　ｓＣＫ　ｓＭ　ｓＭＮＰＫ　ｓＮＰＫ　处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　图２两种作物季不同施肥土样中微生物门水平的组成（相对丰度＞１％）　Ｆｉｇ．２　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ（Ａｔ　ｐｈｙｌｕｍ　ｌｅｖｅｌ，　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ＞１％、　４４１４　中国农业科学　４９卷　表５两种作物季不同施ＢＳ＋壤中微生物纲水平的组成（８组中至少有１组的相对丰度＞１％）　Ｔａｂｌｅ　５　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ（Ａｔ　ｃｌａｓｓ　ｌｅｖｅｌ，ａｔ　ｌｅａｓｔ　ｏｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｅｉｇｈｔ　ｇｒｏｕｐｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ＞１％、　表６微生物组成与土壤化学性质Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析　Ｔａｂｌｅ　６　Ｐｅａｒｓｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｏｉｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　９．９４％一ｌ１．７９％￣Ｈ　ＩＩ．０５％一１６．９％。Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　在大豆季ｓＭＮＰＫ（１４．９７％）和ｓＮＰＫ（１６．９０％）之间　的相对丰度在玉米季各施肥处理没有显著性差异，而　存在显著差异，ｓＣＫ（１１．６６％）和ｓＭ（１１．０５％）之间　２２　ｊｆＪＪ　建莉等：尔北黑　：微生物抖落对长ｊＪｆＪ施肥及作物的响应　４４１　５　没仃｛【Ｉ！著性芹　。Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ的相埘卜度在　ｓＭＮＰＫ和ｓＮＰＫ处　比／ｆ　施肥处理增７ＪＩＪ　１．７２％和　度，　施处　ｌｉ米季３个施肥处　问没仃筹异，　与　施肥处　｛Ｉ　著商ｊ　／１　施肥与尢机肥处　。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ＿卡ｕ　１＝，｛　！　著芹片；而　：火～了．季的有机肥处理和有机尢机　１．２％。另外，Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ相对丰度与土壤化学性质　Ｐｅａｒｓｏｎ干ｆ１天性分析（表６），Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ相对丰度　ｊ　ｐＨ极显并负　关；与硝态氮、铵态氮、有效磷和　速效钾含　极　著正相关。　从　５中数据　永，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ门『１１的　刈一卜度　ｊ铵态氮　１速效钾含毋极　著负相关。　２．５不同作物季和施肥处理的聚类分析　通过聚类分析，　宵科｛似Ｂ多样性的供试样品聚　类　‘起，术研究　处理的结果（图３）显示主要聚　‘分支由Ｉ—ｊ一作物季的各个施肥处　类成　人分１支，缚Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ纲　下米季的相对＝　度为０．８１％一　１．１６％，人　零的提高剑３．６１％一３．５４％，相Ｉ叫作物季　【，ＦＪ４＜『　施肥处　问没仃显著性差异。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ相　聚类组成。Ｋ米季的ｍＮＰＫ处理的几个甲行先行市Ｈ　聚，Ｉｌｆ依次　ｍＭＮＰＫ、ｍＭ和ｍＣＫ聚类；大　季则　址ｓＣＫ　ｊ　ｓＭ先聚类，而后依次与ｓＭＮＰＫ和ｓＮＰＫ　聚类。　埘　度与＿个＝氮皿著负相关；与铵态氮和速效钾含最极　ｌｌ　相２－。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ门中的Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ的相对丰　ｍＣＫ３　ｍＣＫ２　ｍＣＫｌ　ｍＭｌ　ｍＭ３　ｉｎＭ２　０　１　０　０　言苎蛊　吞茎　ｌ８　ｉ耋８星兰置焉　　ｉ　ｉ　茎薹　ｂ萎　差警量善急基　耄堇　ｕ一　．ａ　’。　０　２　＇－图３　两种作物季不同施肥处理的ｐ多样性分析　Ｆｉｇ．３　Ｉｊ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｒｏｐ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｅａｓｏｎｓ　中国农业科学　４９卷　３　讨论　３．１　不同作物和施肥处理影响黑土中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因　丰度的变化　本研究表明，大豆季黑土中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因丰度　明显高于玉米季，大豆季的有机肥配施无机肥处理　１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的拷贝数比玉米季的提高了１．６０倍。　因此可知，种植不同作物是影响土壤１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因　丰度的一个重要因素，种植大豆提高了土壤１６Ｓ　ｒＲＮＡ　基因丰度。另外，ＨＡＮ等【　８］利用平板计数的研究也发　现豆科植物能够明显增加可培养微生物数量。其原因　可能是因为种植作物根系分泌物的不同，而引起根系　周围及其土壤中细菌等微生物种群结构的变化，大豆　是豆科作物，其根瘤内部具有固氮能力的根瘤菌，能　为土壤微生物提供更多的氮源；同时大豆根系分泌物　中脂肪酸较多，能活化土壤中难溶的养分，提供更多　营养物质，更有利于土壤中微生物的生长繁殖［。　。　ＺＨＯＵ等　］研究发现长期施用氮肥会显著降低土　壤中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的拷贝数。而ＷＥＳＳＥＮ等【　０］研究　得出施用无机肥钙和硫酸铵会提高１６Ｓ　ｒＲＮＡ基　因的拷贝数。我们的研究表明，无机肥处理并没有降　低基因拷贝数，施用有机肥，尤其是有机肥配施无机　肥能显著提高基因拷贝数。且土壤中１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因　拷贝数与土壤化学性质有明显的相关性（与硝态氮、　速效钾含量显著正相关，而与铵态氮含量负相关）。　前面分析已知土壤化学性质同时受施肥和作物的影　响，进一步表明黑土中微生物的丰度的变化是施肥和　作物共同作用的结果。　３．２不同作物和施肥处理对黑土中微生物多样性的　影响　本研究发现在同一处理中，大豆季的土壤微生物　多样性明显高于玉米季，如有机肥配施无机肥处理的　Ｃｈａｏｌ指数大豆季比玉米季提高了１６．６０％。此外，　ｗＵ等ｌｌ　６Ｊ研究长期定位试验站的红壤水稻土，结果表　明有机肥配施无机肥处理的土壤微生物多样性与无机　肥处理之间没有显著性差异；而ＴＩＡＮ等【　发现大量　施用有机粪肥较无机肥降低土壤微生物多样性。我们　的研究与ＤＯＡＮ　】的发现一致，即有机肥无机肥配　施的微生物多样性高于无机肥。这可能与土壤类型和　施肥的时间有关系，ＴＩＡＮ是短期定位实验（３年），　而本研究是基于３５年以上的长期定位实验的结果。　本文的聚类分析表明，群落结构按照作物季分成　明显的两大簇，说明其存在较大差异，同时，同一簇　的４个不同施肥处理相互比较，得知不同施肥方式也　引起了群落结构问的差异。与有机肥无机肥配施相比，　施无机肥对黑土土壤微生物群落结构改变更大。因此，　长期施肥导致的东北黑土中微生物群落的变化跟作物　种类、气候和降水等因素相关，但各因素作用的程度　如何还不得而知。同时，根据土壤微生物多样性指数　与化学指标的相关性分析，可知多样性指数与土壤全　氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质密　切相关。　３．３　不同作物和施肥处理对黑土中微生物组成的影响　本研究表明在大豆和玉米季中的土壤微生物组成　存在较大差异。玉米季的古菌所占比例（７．５３％一　１１．６２％）高于大豆季（仅占２．７０％—４．１０％）；玉米季　Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ是细菌中相对丰度最高的菌门，而大豆　季相对丰度最高的菌门是Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ；玉米季的　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ相对丰度较高而在大豆季较低，大豆季　的Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ相对丰度较高而在玉米季较低。　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ和Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ丰度在两季作物中差异　明显，作物影响微生物组成，这个结果与以前的报道　一致［　，　１。且同一作物不同施肥处理之间也存在差　异，如Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ和Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ相　对丰度变化较大，施肥处理均比不施肥处理的相对丰　度提高，对有机肥配施无机肥和无机肥均比较敏感。　Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ的相对丰度不同施肥处理之间没有明显　差异。Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ在不施肥处理具有较高相对　丰度，而对有机肥配施无机肥、有机肥和无机肥均表　现不稳定性。以上分析得知，作物和施肥均改变了土　壤微生物的群落组成，组成的改变是否会引起土壤微　生物整体代谢功能的变化，还有待于更深入的研究。　根据土壤微生物组成（门水平）与化学指标的相　关性分析，可知微生物组成与土壤ｐＨ、全氮、硝态氮、　铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质密切相关。土壤　质量的改变是缓慢的、长期积累的效应，土壤微生物　随着土壤性质的改变而改变。而本论文没有关于施肥　和作物引起微生物数量、多样性等变化的贡献量进行　量化分析，以及施肥与作物交互作用机理等的研究，　这些问题还需进一步研究探讨。　４结论　本研究表明，施肥和不同作物均对东北黑土土壤　微生物丰度、０【多样性和群落结构产生了影响。连续　施用无机肥会导致土壤酸化，而有机肥无机肥配施能　有效地提高土壤ｐＨ，缓解酸化。且土壤化学性质与土　２２期　丁建莉等：东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应　４４１７　壤微生物群落变化具有相关性。有机肥配施无机肥显　著增加了黑土中微生物的１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因拷贝数，而　无机肥对其影响不显著；大豆种植季的１６Ｓ　ｒＲＮＡ基　因拷贝数显著高于玉米种植季。有机肥配施无机肥的　ｃｃ多样性指数高于无机肥；大豆种植季的　多样性指　数较玉米种植季的高。　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　［１】　ＹＴＮ　Ｃ，ＦＡＮ　Ｅ　ＳＯＮＧ　Ａ，ＣＵＩ　Ｐ’ＬＩ　Ｌ　ＬＩＡＮＧ　Ｙ．Ｄｅｎｉｔｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅｓ　ｉｓ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，９９：５７１９—５７２９．　［２】　ＫＲＡＳＨＥＶＳＫＡＶ，ＫＬＡＲＮＥＲ　Ｂ，ＷＩＤＹＡＳＴＵＴＩ　Ｒ，ＭＡＲＡＵＮ　Ｍ，　ＳＣＨＥＵ　Ｓ．Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｔｒｏｐｉｃａｌ　ｌｏｗｌａｎｄ　ｒａｉｎｆｏｒｅｓｔ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｒｕｂｂｅｒ　ａｎｄ　ｏｉ１　ｐａｌｍ　ｐｌｎａｔａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｏｆＳｏｉ／ｓ，２０１５，５１（６）：６９７－７０５．　【３］　乔洁，毕利东，张卫建，沈仁芳，张斌，胡锋，刘艳丽．长期施用化　肥对红壤性水稻土中微生物生物量、活性及群落结构的影响．土　壤，．２００７，３９（５）：７７２—７７６．　ＱＩＡＯ　Ｊ，ＢＩＬＤ，ＺＨＡＮＧＷ　Ｊ，ＳＨＥＮＲＦ，ＺＨＡＮＧＢ，ＨＵＦ，ＬＩＵＹ　Ｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ，ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｐａｄｄｙ　ｓｏｉｌ　ｉｎ　ｒｅｄ　ｓｏｉｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ．Ｓｏｉｌｓ，２００７，３９（５）：７７２－７７６．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　［４】ＪＯＲＱＵＥＲＡＭＡ，ＭＡＲＴＩＮＥＺＯＡ，ＭＡＲ／ＬＥＯ　ＬｑＡＣＵＮＡ　Ｊ　Ｊ，　ＳＡＧＧＡＲ　Ｓ，ＭＯＲＡ　Ｍ　Ｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｌａ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ＣｈｉｌｅａｎＡｎｄｉｓｏｌ　ｐａｓｔｕｒｅｓ．ＷｏｒｌｄＪｏｕｎａｌ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２０１４，３０，９９－１０７．　［５】ＢＥＡＵＲＥＧＡＲＤ　Ｍ　Ｓ，ＨＡＭＥＬ　Ｃ，ＡＴＵＬ　Ｎ，ＡＲＮＡＵＤ　Ｍ　Ｓ．　Ｌｏｎｇ・ｔｅｒｍ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｍｐａｃｔｓ　ｓｏｉｌ　ｆｏｎｇａｌ　ａｎｄ　ｂａｃｔｒｅｉａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｙｔｂｕｔｎｏｔＡＭｆｕｎｇａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔｉｎ　ａｌｆａｌｆａ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，　２０１０，５９（２）：３７９—３８９．　［６】ＢＯＲＪＥＳＳＯＮ　Ｇ　ＭＥＮＩＣＨＥＴＴＩ　Ｌ，ＫＩＲＣＨＭＡＮＮ　Ｈ，ＫＸＴＴＥＲＥＲ　Ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　５３　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｎｉｒｔｏｇｅｎ　ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｙｔ　ｆｏＳｏｉｌｓ，２０１２，４８（３）：２４５－２５７．　［７】ＢＥＲＴＨＲＯＮＧ　Ｌ　ＢＵＣＫＬＥＹ　Ｄ　Ｈ，ＤＲＩＮＫＷＡＴＥＲ　Ｌ　Ｅ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｌａｂｉｌｅ　ｃａｒｂｏｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎｓ　ａｆｆｅｃｔ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｓｎ１ｌｃｎｌｒｅ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｗｉｈｔ　ｃａｒｂｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｒｔｏｇｅｎ　ｃｙｃｌｉｎｇ．　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２０１３，６６（１）：１５８—１７０．　【８】ＷＥＩＤ，ＹＡＮＧＱ，ＺＨＡＮＧ　ＪＺ，ＷＡＮＧ　Ｓ，ＣＨＥＮＸ，ＺＨＡＮＧＸ，ＬＩ　Ｗ　Ｑ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｓｔｍｃ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｙｔ　ｉｎ　ａ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ　ａｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅ，２００８，１８（５）：５８２－５９２．　［９］９　ＣＡＲＬＳＯＮ　Ｊ，ＳＡＸＥＮＡ　Ｊ，ＢＡＳＴＡ　Ｎ，ＨＵＮＤＡＬ　Ｌ，ＢＵＳＡＬＡＣＣＨＩ　Ｄ，ＤＩＣＫ　Ｒ　Ｐ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｍａｅｎｄｍｅｎｔｓ　ｔｏ　ｒｅｓｔｏｒｅ　ｄｅｇｒａｄｅｄ　ｓｏｉｌ：Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ａｎｄＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，２０１５，１８７（３）：１－１５．　［１０］ＰＥＡＣＯＣＫ　Ａ　Ｄ，ＭＵＬＬＥＮ　Ｍ　Ｄ，ＲＩＮＧＥＬＢＥＲＧ　Ｄ　Ｂ，ＴＹＬＥＲ　Ｄ　Ｄ，　ＨＥＤＲＩＣＫ　Ｄ　Ｂ，ＧＡＬＥ　Ｐ　Ｍ，ＷＨＩＴＥ　Ｄ　Ｃ．Ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｄａｖｙ　ｍａｎｕｒｅ　ｏｒ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｎｉｒｔａｔｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｏｉｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，３３：１０１１－１０１９．　【ｌ１］魏巍，许艳丽，朱琳，韩晓增，Ｌｊ　Ｓ．长期施肥对黑土农田土壤微生　物群落的影响．土壤学报，２０１３，５０：３７２—３８０．　ＷＥＩ　Ｗ　ＸＵ　Ｙ　Ｌ，ＺＨＵ　Ｌ，ＨＡＮ　Ｘ　Ｚ，ＬＩ　Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｆａｒｍｌｎａｄ　ｏｆ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ．　Ａｃｔａ　Ｐｅｄｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１３，５０：３７２—３８０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　【１２】ＬＩＵ　ＳＨＩ　Ｇ　ＭＡＯ　Ｌ’ＣＨＥＮＧ　Ｑ　ＪＩＡＮＧ　Ｓ，ＭＡ　Ｘ，ＡＮ　Ｌ，ＤＵ　Ｇ　ＪＯＨＮＳＯＮ　Ｎ　Ｃ，ＦＥＮＧ　Ｈ．Ｄｉｒｅｃｔ　ａｎｄ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　８　ｙｒ　ｏｆ　ｎｉｒｔｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ　ｉｎ　ｎａ　ａｌｐｉｎｅ　ｍｅａｄｏｗ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２０１２，１９４：５２３—５３５．　［１３］ＺＨＡＯ　Ｊ，ＮＩ　Ｌ　ＬＩ　ＸＩＯＮＧ　ＲＡＮ　ＳＨＥＮ　Ｂ，ＳＨＥＮ　Ｑ，　ＺＨＡＮＧ　Ｒ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａｒａｂｌｅ　ｓｏｉｌｓ　ｉｎ　ａ　ｉｒｃｅ－ｗｈｅａｔ　ｃｒｏｐｐｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｒｅｇｉｍｅｓ　ａｎｄ　ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｔｉｍｅｓ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１４，９（１）：ｅ８５３０１．　【１４】蔡艳，郝明德，张丽琼，臧逸飞，何晓雁．应用４５４测序技术分析　种植制度对黑垆土微生物多样性的影响．作物学报，，２０１５，４１（２）：　３３９．３４６．　ＣＡＩ　Ｙ，ＨＡＯ　Ｍ　Ｄ，ＺＨＡＮＧ　Ｌ　Ｑ，ＺＡＮＧ　Ｙ　Ｆ，ＨＥ　Ｘ　Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｒｏｐｐｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｙｔ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ　ｌｏｅｓｓｉａｌ　ｓｏｉｌ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　４５４　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｃｔａ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，４１（２）：　３３９－３４６．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　［１５］ＫＩＥＬＹ　Ｐ　Ｄ，ＣＡＬＬ　Ｄ　Ｅ　ＹＡＴＥＳ　Ｍ　Ｄ，ＲＥＧＡＮ　Ｊ　Ｍ，ＬＯＧＡＮ　Ｂ　Ｅ．　Ａｎｏｄｉｃ　ｂｉｏｆｉｌｍｓ　ｉｎ　ｍｉｅｒｏｂｉｌａ　ｆｕｅｌ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｒｂｏｒ　ｌｏｗ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ－ｐｏｗｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｈａｎ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｇｅｎｅｒａ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，８８（１）：３７１—３８０．　【１６】ＳＨＯＫＲＡＬＬＡ　Ｓ，ＳＰＡＬＬ　Ｊ　Ｌ，ＧＩＢＳＯＮ　Ｊ　Ｅ　ＨＡＪＩＢＡＢＡＥＩ　Ｍ．　Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ＤＮＡ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２１（８）：１７９４－１８０５．　【１７】ＺＨＯＵ　Ｊ，ＧＵＡＮ　Ｄ，ＺＨＯＵ　Ｂ，ＺＨＡＯ　Ｂ，ＭＡ　Ｍ，ＱｒＮ　Ｊ，ＪＩＡＮＧ　Ｘ，　ＣＨＥＮ　Ｓ，ＣＡＯ　Ｅ　ＳＨＥＮ　Ｄ，ＬＩ　Ｊ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　３４一ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａｎ　ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ　ｉｎ　ＮｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，９０：４２－５１．　０８］秦杰，姜昕，周晶，马鸣超，关大伟，周宝库，赵百锁，杜秉海，李　俊．长期不同施肥黑土细菌和古菌群落结构及主效影响因子分析．　植物营养与肥料学报，２０１５，２１（６）：１５９０—１５９８．　ＱＩＮ　Ｊ，ＪＩＡＮＧ　Ｘ，ＺＨＯＵ　Ｊ，ＭＡ　Ｍ　Ｃ，ＧＵＡＮ　Ｄ　ＺＨＯＵ　Ｂ　Ｋ，　４４１８　中国农业科学　４９卷　ＺＨＡＯ　Ｂ　Ｓ，ＤＵ　Ｂ　Ｈ，ＬＩ　Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｄｒｉｖｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｂａｃｔｅｒｉ　ａｎｄ　ａｒｃｈａｅａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅｓ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ，２０１　５，　２１（６）：１５９０—１５９８．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　［１９］ＺＨＯＵ　Ｊ，ＪＩＡＮＧＸ，ＺＨＯＵＢ，ＭＡＭ，ＧＵＡＮＤ，ＬＩ　Ｊ，ＣＨＥＮ　Ｓ，ＣＡＯ　Ｆ，ＳＨＥＮ　Ｄ，ＱＩＮ　Ｊ．Ｔｈｉｒｔｙ　ｆｏｕｒ　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｎｉｒｔｏｇｅｎ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｆｕｎｇａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒｓ　ｆｕｎｇａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ　ｓｏｉｌ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ．Ｓｏｉｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，　９５：ｌ３５．１４３．　［２０］ｗＵ　Ｍ，ＱｒＮ　Ｈ，ＣＨＥＮ　Ｚ，ＷＵ　Ｊ，ＷＥＩ　Ｗ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｏｎｇ。ｔｅｒｍ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｐａｄｄｙ　ｓｏｉｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｏｆＳｏｉｌｓ，２０１１，４７（４）：３９７－４０５．　［２ｌ】ＤＩＮＧ　Ｘ，ＨＡＮ　Ｘ，ＺＨＡＮＧ　Ｘ，ＱＩＡＯ　ＬＩＡＮＧ　Ｙ－Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｍａｎｕｒｉｎｇ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ａｆｆｅｃｔｓ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ａ　Ｍｏｌｌｉｓｏ１．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｙｔ　ｏｆ　Ｓｏｉｌｓ，２０１　３，４９（４）：　３８７．３９３．　［２２］ＭＵＬＶＡＮＥＹ　Ｒ　Ｌ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎ—ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｆｏｒｍｓ／／Ｂｉ【ｇｈａｍ　Ｊ　Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ　Ｓｏｉｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐａｒｔ　３．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，ＡＳＡ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，１９９６：１　１２３－１２００．　［２３］鲁如坤．土壤农业化学分析方法．北京：中国农业科技出版社，　１９９９，４３　１－４７２．　Ｌｕ　Ｒ　Ｋ．Ｓｏｉｌ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９９：４３１－４７２．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　【２４］ＰＥＩＦＦＥＲ　ＪＡ，ＳＰＯＲＡ，ＫＯＲＥＮＯ，ＪＩＮ　Ｚ，ＴＲＩＮＧＥ　ＳｑＤＡＮＧＬ　Ｊ　Ｌ，ＢＵＣＫＬＥＲ　Ｅ　Ｓ，ＬＥＹ　Ｒ　Ｅ．Ｄｉｖｅｒｓｉｙｔ　ａｎｄ　ｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｙｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　ｕｎｄｅｒ　ｆｉｅｌｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２０１３，　ｌ　１０（１６）：６５４８・６５５３．　［２５】ＣＨＩＮＮＡＤＵＲＡＩ　Ｃ，ＧＯＰＡＬＡＳＷＡＭＹ　Ｇ　ＢＡＬＡＣＨＡＮＤＡＲ　Ｄ．　Ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｒｅｇｉｍｅｓ　ｏｎ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｆｏｒ　ｆｅｒｔｉｌｉｙｔ　ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｓｅｍｉ—ａｄｄ　ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｌｉｆｓｏ１．Ｇｅｏｄｅｒｍａ，２０１４，２３２：　５６３－５７２．　［２６］ＣＨＥＮ　Ｊ，ＢＩＴＴＩＮＧＥＲ　Ｋ，ＣＨＡＲＳＯＮ　Ｅ　Ｓ，ＨＯＦＦＭＡＮＮ　Ｃ，ＬＥＷＩＳ　Ｊ，　ＷＵ　Ｇ　Ｄ，ＣＯＬＬＭＡＮ　Ｒ　Ｇ　ＢＵＳＨＭＡＮ　Ｆ　Ｄ，ＬＩ　Ｈ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｗｉｈｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｃｏｖａｒｉａｔｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ＵｎｉＦｒａｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２，２８（１６）：２１０６・２１１３　［２７】ＹＵ　Ｘ，ＷＵ　Ｃ，ＦＵ　ＢＲＯＯＫＥＳ　Ｐ　Ｃ，ＬＵ　Ｓ．Ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｐｏｒｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｃｈａｒ－　ａｍｅｎｄｅｄ　ｓｏｉｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，６７（１）：　１Ｏ９．１２Ｏ　【２８］ＨＡＮＸ，ＷＡＮＧＲ，ＬＩＵ　Ｊ，ＷＡＮＧＭ，ＺＨＯＵ　Ｊ，ＧＵＯ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎｔｙｐｅｓ　ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｔａｂｏｌｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｎａ．　Ｊｏｕｒｎａ，ｏｆＥｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１９（１０）：１２２８－１２３４．　［２９］李晓慧，韩晓增，王树起，王守宇，彦君．土壤微生物对不同作物　根系活动的响应．农业系统科学与综合研究，２０１０，２６（２）：１５６－１５９．　ＬＩ　Ｘ　Ｈ．ＨＡＮ　Ｘ　Ｚ，ＷＡＮＧ　Ｓ　Ｑ，ＷＡＮＧ　Ｓ　Ｙ，ＹＡＮ　Ｊ．Ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ａｍｏｕｎｔ　ａｎｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｒｏｐ　ｒｏｏｔｓ．Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０１０，　２６（２）：１５６—１５９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　［３０］ＷＥＳＳｔ￣ＮＥ，ＨＡＬＬＩＮ　Ｓ，ＰＨＩＬＩＰＰＯＴ　Ｌ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ａｒｃｈａｅａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ　ｒａｎｋｓ　ｔｏ　ｓｏｉｌ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｓｏｉｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４２（１０）：　１７５９．１７６５．　［３１］ＴＩＡＮ、ｖ＇ＷＡＮＧＬ，ＬＩ　ＺＨＵＡＮＧＫ，ＬＩ　Ｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ，ＸＩＡＯＸ，ＸＩ　Ｙ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｙｔ，ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｓｏｉｌ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｍａｎｕｒｅ—ｂａｓｅｄ　ｃｏｍｐｏｓｔ　ａｎｄ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１５，２１３：２１９－２２７．　【３２】ＤＯＡＮ　Ｔ　ＢＯＵＶＩＥＲ　Ｃ，ＢＥＴＴＡＲＥＬ　ＢＯＵＶＩＥＲ　Ｔ，　ＨＥＮＲＹ－ＤＥＳ．ＴＵＲＥＡＵＸ　Ｌ　ＪＡＮＥＡＵ　Ｊ　Ｌ，ＬＡＭＢＡＬＬＥ　Ｐ，ＶＡＮ　ＮＧＵＹＥＮ　Ｂ，ＪＯＵＱＵＥＴ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｂｕｆｆａｌｏ　ｍａｎｕｒｅ，ｃｏｍｐｏｓｔ，　ｖｅｒｍｉｃｏｍｐｏｓｔ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈａｒ　ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ａｎｄ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ａｑｕａｔｉｃ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｏｉｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１４，７３：７８－８６．　【３３】ＺＨＡＯ　Ｊ，ＮＩＬ　ＬＩ　Ｊ，ＬＵＱ，ＦＡＮ　ＦＺ，ＨＵＡＮＧＱ，ＺＨＡＮＧＲ，ＬＩＲ，　ＳＨＥＮ　Ｂ，ＳＨＥＮ　Ｑ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ－ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｗｉｈｔ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｒｏｐ　ｙｉｅｌｄｓ，ｓｏｉｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｙｔ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ａ　ｒｉｃｅ－ｗｈｅａｔ　ｃｒｏｐｐｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１６，９９：１－１２．　（责任编辑杨鑫浩）