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１３４ 安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ ａｇｒｉ．Ｓｃｉ Ｂｕｌ１．２００８，１４（１４） 不同诱变方法提高绿色木霉产纤维素酶的研究 林建国 王常高 王伟平 胡 瑛 蔡 俊 （湖北ｌ丁业大学生物工程学院工业微生物湖北省重点实验室，湖北武汉４３００６８） 摘要：该文阐述了紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍三种诱变方法对发菌株绿色木霉ＴＶ一９６进行诱变以提高其产酶的 能力。确定了紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍的最佳诱变时间分别为：１ ２Ｏ秒、３５分钟和２．５分钟；得到了３１株菌株的 Ｈｃ值比出发菌株大，通过复筛，发现３１株菌株中，有２２株的产酶能力比出发菌株有提高，且突变菌株ＮＴＧ８的产酶能 力最高值为４ ３７ ｇＧ／ｍｌ・ｍｉｎ，是出发菌株的２．０３倍，并具有较好的遗传稳定性。 关键词：绿色木霉；纤维素酶；诱变 中图分类号ｓ７６ ３ 文献标识码Ｂ 文章编号１ ００７—７ ７ ３１（２００８）１ ４－１ ３４—０３ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｌｉｎ Ｊｉａｎｇｕｏ Ｗａｎｇ Ｃｈａｎｇｇａｏ ＷａｎｇＷｅｉｐｉｎｇ Ｈｕ Ｙｉｎｇ Ｃａｉ Ｊｕｎ （Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕｂｅｉ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗ ｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ，４３００６８） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ｓｔｒａｉｎ ＴＶ－９６，ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｂｒｅｗｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ，ＤＥＳ ａｎｄ ＮＴＧ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｂｙ ＵＶ， ＤＥＳ ａｎｄ ＮＴＧ ｗｅｒｅ １ ２０ ｓｅｃｏｎｄｓ，３５ｍｉｎｕｔｅｓ ａｎｄ ２．５ ｍｉｎｕｔｉｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ３ １ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｔ ｈｉｇｈｅｒ Ｈｃ ｔｈａｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅ ｏｆ ２２ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＮＴＧ８ ｗｈｉｃｈ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２．０３ ｔｉｍｅｓ，ａｎｄ ｇｅｔ ｈｉｇｈｅｓｔ ４３７ ｇＧ／ｍｌ ｍｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｍｕｔａｔｉｏｎ 纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚 实验室保藏。 糖酶、外切葡聚糖酶及Ｂ一葡萄糖苷酶。纤维素酶可应用于 １．１．２药品。硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、亚硝基胍（ＮＴＧ）、羧甲基纤 以植物为原料（主要成分为纤维素）的一切工业中，如纺织、 维素钠（ＣＭＣ）３００—８００、去氧胆酸钠、刚果红、３，５一二 饲料和食品加工、医药、日用化工等方面。特别是在饲料工 硝基水杨酸、重蒸酚、无水亚硫酸钠等均为化学纯，购于武 业中，使用纤维素酶是提高植物性饲料消化率和利用率的 汉华顺生物工程有限公司；秸秆粉碎细度为１２０目。 有效措施。实践证明，添加纤维素酶后可使畜禽增重１５％， １．２方法。 同时饲料用量可降低１０％口】。能产生纤维素酶的微生物有 １．２．１菌种的活化。保藏菌株Ｔｖ一９６在ＰＤＡ【２ 斜面活化２次。 细菌及青霉，曲霉，木霉等真菌。绿色木霉是产纤维素酶的 １．２．２选择培养基。Ｍａｎｄｅｌ ｓ营养盐液 中Ｄｆｌ（ｍｌｖ１：０．１２％去 重要菌株，提高菌株的产酶能力也是纤维素酶相关研究的 氧胆酸钠、０．０１％刚果红、Ｉ％ＣＭＣ和０．８％琼脂。 核心问题。 １．２．３诱变方法 。（１）孢子悬液的制备：用无菌水洗下 本研究选用了紫外（ｕＶ＞诱变、硫酸二乙酯（ＤＥＳ）和亚 经活化的斜面孢子，置于玻璃小三角瓶中振荡２０ｍｉｎ后用４ 硝基胍（ＮＴＧ）三种诱变方法对出发菌株进行诱变，并通过 层镜头纸过滤，适当稀释，使孢子浓度为１０５～６个／ｍｌ。（２） 发酵试验，选育产酶活力高的突变菌株。 ｕＶ诱变：取５ｍｌ孢子液于直径９ｃｍ平皿中，置３０ｗ紫外灯管 １材料与方法 下，距离约２５ｃｍ，照射一定时间后，在红灯下稀释适当倍 １．１材料 数，取０．１ｍｌ涂平板３０￣Ｃ避光培养，计平板菌落数，计算致死 １．１．１出发菌株。绿色木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）ＴＶ一９６为本 率，绘制致死曲线。（３）硫酸二乙酯诱变：取２０ｍｌ孢子悬浮 作者简介：林建国（１９７９一），男，湖北仙桃人，博士，从事生物工程研究。 收稿日期：２００８—０５—２８ 维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ Ａ ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌ１．２００８，１４（１４） １３５ 液，４ ５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后去掉上清液，加无菌水１９．８ｍｌ 二乙酯诱变时间选择３５ｍｉｎ； 和０．２ｍｌ硫酸二乙酯，立即混合振荡，处理一定时间后，取 ０．５ｍｌ处理液，加入到４．５ｍｌ１％Ｎａ２Ｓ２０３液中解毒，稀释后取 ２．１．３亚硝基胍诱变结果详见图３。从图３可知，当诱变时间 ０．１ｍｌ涂平板，３０℃培养，计平板菌落数，计算致死率，绘制 致死曲线。（４）亚硝基胍诱变：取孢子液２ｍｌ，加，Ａ０．３ｇ／ＤＳＩＥ硝 基胍和０．２ｍｏｌ／１ ｐＨ４．４醋酸缓冲液（各ｌｍ１），３７℃保温处理 一定时间后，取２ｍ１］ＪＩ］入１０ｍｌ ０．０７ｍｏｌ／１ Ｎａ２ＨＰＯ４液中止， 稀释后取０．１ｍｌ涂平板，３０℃培养，计平板菌落数，计算致 死率，绘制致死曲线。 １．２．４致死率的计算及菌株初筛。其致死率公式为： 致死率㈩；魍 ｔ 以７０～８０％的致死率确定诱变时间，诱变后，在有刚 果红的平板上挑取ＨＣ值（透明圈直径与菌落直径之比），比 ＴＶ一９６大的菌株进行发酵复筛。 １．２．５复筛：复筛采用液态发酵，将挑选的ＨＣ值较大的菌株 进行液态发酵试验，测定每株菌株发酵液的酶活性。 １．２．６液体发酵培养基：将０．５％ＣＡＣＯ３、０．１％蛋白胨溶解 在Ｍａｎｄｅｌ’Ｓ营养盐液中，分装于２５０ｍｌ－－角瓶，每瓶装量为 ３０ｍｌ，然后每瓶加入预处理的稻草粉０．９ｇ，包扎灭菌。 稻草粉预处理：稻草经ｌｍｏｌ／１ＮａＯＨ液０．１Ｍｐａ下蒸煮 ３０ｍｉｎ，水洗至中性，干燥、粉碎过４０目筛。 １．２．７ ＣＭＣ酶活的测定。参考路福平酶活测定方法 】：取试 管若干，每管加入适当稀释酶液０．５ｍｌ，ＣＭＣ缓冲液２．０ｍｌ 混匀，于４０℃恒温水浴中酶解３０ｍｉｎ，取出后加入ＤＮＳ试剂 ２．５ｍｌ。另外备一只空白管，于其中加入ｐＨ５．０的磷酸氢二 钠一柠檬酸缓冲溶液２．５ｍｌ，ＤＮＳ试剂２．５ｍｌ，将两试管同 时放入沸水中煮沸５ｍｉｎ，取出于冷水中冷却至室温。７２２ 型分光光度计于５２０ｎｍ光波下比色，测出样品０Ｄ值（使ＯＤ 值在０．２～０＿８范围），查阅标准曲线，计算出酶活。 酶活力单位定义：在ｐＨ５．０，４０℃下，每ｌｍｌ酶液在１ｍｉｎ 内水解ＣＭＣ生成１微克葡萄糖，称作一个纤维素酶（ＣＭＣ 酶）活力单位（ｕ）。计算公式如下： ＣＭＣＩ￣＝ （ ｌ￣．ｍｉｎ） 式中Ｇ为生成葡萄糖微克数；Ｎ为酶液稀释倍数；０．５为 酶液体积数；３０为酶解时间（ｍｉｎ）。 ２结果与分析 ２．１不同诱变方法的致死曲线及诱变时间的确定。 ２．１．１紫外（ｕＶ）诱变致死曲线。结果详见图１。从图１可知， 当诱变时间为１２０ｓ时，致死率为７８．６％，而当诱变时间大于 １２０ｓ或小于１２０ｓｌ￣，其致死率都不在７０～８０％之间。因此， 紫外诱变时间选择１２０ｓ； ２．１．２硫酸二乙酯诱变。结果详见图２。从图２可知，当诱变时 间为３５ｍｉｎ时，致死率为７７．５％，而当诱变时间大于３５ｍｉｎ或 小于３５ｍｉｎ时，其致死率都不在７０～８０％之间，因此，硫酸 一 蒉 髹 蠡｝ Ｏ ∞ 柏 ６ｏ ∞＇ｏＤ １ １４０ １６ｏ １∞２０Ｄ 时闻（杪） 嘲Ｉ 紫外诱变致死曲线 ｌ∞ ∞ ＾ ∞ 瓣 萋柏 ∞ Ｏ ０ １０ ２ｏ ３０ ４０ ５０ 时间（分钟） 嘲２碱酸＝己穗诱变致死ｌＩｌｌ线 ｌ０ｏ ８ｏ 窑６。 蛋 萋柏 ２Ｏ ０ ２ ３ ４ 时阅（分钟） 网３ 哑刚罄瓤诱变诱变曲线 为２．５ｍｉｎ时，致死率为７９＿３％，而当诱变时间大于２．５ｍｉｎ或 小于２．５ｍｉｎＥｌ－，ｊ＂，其致死率都不在７０～８０％之间，因此，亚硝 基胍诱变时间选择２．５ｍｉｎ。 ２．２不同诱变方法所得突变菌株的透明圈ＨＣ值。对于不同 的诱变方法，在最佳诱变条件下进行诱变，将诱变后的孢 子液涂布到含有刚果红的平板上，待有菌落产生时，计算 表１ 不同诱变方法所得菌株透明圈的Ｈｃ值 ＨＣ值，其结果详见表１。表１中，ｕＶ系列编号代表紫外诱变， 维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ３６ 安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌ１．２００８，１４（１４） ＤＥＳ系列编号代表硫酸二乙酯诱变，ＮＴＧ系列编号代表亚 硝基胍诱变，ＴＶ一９６代表出发菌株。 由表１可知，通过计算透明圈的ＨＣ值，得到３１株菌株的 性试验，突变菌株ＮＴＧ８有较好的遗传稳定性。 ３结论 ３．１确定了紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍对绿色木霉ＴＶ－９６ ＨＣ值比出发菌株ＴＶ一９６大，因此，选择这３１株突变菌株进 行复筛试验，测定每株微生物发酵液酶的活力，以出发菌 株作对比，确定高产菌株。 ２．３液态发酵复筛。 每一菌株的斜面菌种用无菌水制成孢子悬液，每３０ｍｌ 诱变的致死曲线及最佳诱变时间。最佳诱变时间分别为： １２０ｓ、３５ｍｉｎ和２．５ｍｉｎ。 ３．２通过计算不同诱变方法所得突变菌株的ＨＣ值，得到了 ３１株菌株的ＨＣ值比出发菌株大。 ３Ｉ３通过复筛，发现３１株菌株中，有２２株的产酶能力比出发菌 发酵液体培养基中接种０．１ｍ１，３０℃，１５０ｒ／ｍｉｎ水浴摇床 培养。将发酵９６ｈ的发酵液用４层纱布过滤，４ ５００ｒ／ｍｉｎ离 心１０ｍｉｎ，取上清液即为粗酶液，用于酶活测定。其结果详 见表２。由表２可知，３１株菌株中，有２２株的产酶能力比出 株有提高，且突变菌株ＮＴＧ８的产酶能力最高值为４３７ ｇＧ／ ｍ１．ｍｉｎ，是出发菌株的２．０３倍，其具有较好的遗传稳定性。 参考文献 …尹麦生，赵学慧．纤维素分解菌黑曲霉ＡＭＳＩ ｌ诱变选育及其酶学 特性研究．第二届真菌学术讨论会［ｃ］．武汉，１９８６． ［２］诸葛健，王正祥．工业微生物实验技术手册［Ｍ］．北京：中国轻工业 出版社．１９９４． 发菌株有提高，且菌株ＵＶ６、ＤＥＳ８、ＮＴＧ５、ＮＴＧ８菌株 产酶能力的提高幅度很大，ＮＴＧ８的产酶能力最高值为 ４３７ ｇＧ／ｍｌ・ｍｉｎ，是出发菌株的２．０３倍。 表２ 液态发酵复筛结果 单位： ｇＧ／ｍｌ・ｍｉｎ ［３］曲音波，高培基，王祖农．青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株 的选育…．真菌学报，１９８４，４：２３８～２４３． ［４］张文治．新编食品微生物学［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９５． 【５］宋小炎，宋桂经，孙彩云等．抗高浓度葡萄糖阻遏的纤维素酶高 产菌的选育…．山东大学学报，１９９９，３４（４）：４８８～４９１． ［６］汪世华，白文钊，吴思方．Ｌ一谷氨酰胺高产菌株的诱变选育…．食 品科学，２００２，２３（３）：６４～６７． 结果表明，采用亚硝基胍对绿色木霉Ｔｖ一９６进行诱变， ［７］路福平．微生物学［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社．１９９７． （何贤芳编，孔爽校） 比紫外诱变和硫酸二乙酯诱变效果要好，通过传代及稳定 （上接４３页） ［１ １］Ｚｉｍａｎｄ Ｇ，Ｅｌａｄ Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｏｎ Ｂｏｔ￣ｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｐａｔｈ。ｇｅｎｉｃｉｔｙ…．Ｐｈｙｔ。ｐａｔｈ０ｌ ｙ，ｔ ９９６，８６：９４５～９５６． ［１２］Ｊｏｎｅｓ Ｒ Ｗ，Ｈａｎｃｏｃｋ Ｊ Ｇ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ ａｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８８， ｌ３４：２０６７～２０７５． ［２０］Ｗｙｓｓｐ，Ｂｏｌｌｅｒｔ，Ｗｉｅｍｋｅｎａ．Ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｒｈｕｓｃｕｌａｒｍｙｃ０ｒｒｈｉｚａ．…．Ｐｌａｎｔ ｓｏｉｌ．１９９２，ｔ４７：１５９～ｔ６２． ［２１］Ｍｅｙｅｒ Ｇ，Ｂｉｇｉｒｉｍａｎａ Ｊ，Ｅｌａｄ Ｙ，ｅｔａ１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏ．…．１９９８， ｌ０４：２７９～２８６． ［２２］Ａｈｍａｄｊｓ，Ｂａｋｅｒｒ．Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｒａｔｅｓ…．Ｃａｎ． Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．１９８８．３４：８０７～８１４． ［１３］焦琮，路炳声．康氏木霉制剂对棉花和菜豆幼苗几个生理生化指 标的影响…．中国生物防治…．１９９５，１１（１）：３０～３２． ［１４］Ａｌｔｏｍａ Ｒ Ｅ，Ｎｏｒｖｅｌｌ验室ｗ Ａ，Ｂ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］，９９９．６５（７）：２９２６～２９３３． ［１５］Ｃｈａｎｇ Ｙ Ｃ，Ｂａｋｅｒ Ｒ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｉｎ ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔ ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒａｉａｎｕｍ．【Ｊ１．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ，１９８６， ７０：ｔ４５～ｔ４８． ［２３］Ｈｏｗｅｌｌ Ｃ Ｒ，Ｈａｎｓｏｒｉ Ｌ Ｅ，Ｓｔｉｐａｎｏｖｉｃ Ｒ Ｄ，ｅｔａ１．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ …．１９９９，８９：２４８～２５２． ［２４］Ｙｅｄｉｄｉａｌ，Ｂｅｎｈａｍｏｕ Ｎ，Ｃｈｅｔ Ｉ．Ａｐ ｅｄ ａｎｄ ｅｍｖｉｍｎｍｅｔａ１．Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］． １９９９．６５（３）：１０６１～１０７０． ［２５］高云超，陈俊秋，张孝祺．广东省微生物肥料的回顾和展望【Ｊ１．生 态科学，２００１，２０（１，２）：２７～３１． ［１６］Ｗｉｎｄａｍ Ｍ，Ｅｌａｄ Ｌ Ｙ，Ｂａｋｒ Ｒ Ａ．ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．…．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１ ９８６， ７６：５１８～５２１． ［２６］ｔ慧中，赵培洁．多效有机菌肥的研制及其特性研究…．江西农 业科学，１９９９，ｌ １（３）：１９～２３． ［２７］Ｌｉｍｏｎ Ｍ Ｃ，Ｐｉｎｔｏｒ Ｊ Ａ，Ｂｅｎｉｔｅｚ Ｔ．Ｐｈｙｔ ０Ｉ】ａｔｈ０ｌｏｇｙ…．１９９９，８９：２ ５４～２６１． ［１７］Ｋｌｅｉｆｅｌｄｏ，Ｃｈｅｔｉ．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．…．Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ，１９９２，１４４：２６７～２７２． ［２８］Ｍｉｇｈｅｌｉ Ｑ，Ｏｎｚｌｅｚ Ｃａｎｄｅｌａｓ Ｌ，Ｄｅａｌｅｓｓ Ｌ，ｅｔａ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．１９９９， ８９：６７３～６７７． ［１８］Ｃａｌｖｅｔｃ Ｐ Ｒ，Ｐｅｒａｊｍ．Ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｍａｒｉｇｏｌｄ（Ｔａｇｅｔｅｓｅｒｅｃｔａｄ．） ｔｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｌｏｍｕｓｍｏｓｓｅａｅ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ ａｎｄ ［２９］ＨａｒａＳ，ＳｃｈｉｃｋｌｅｒＨ，ｅｔａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．１９９６，１４２：２３１２－２３３１． ［３０］Ｐａｌａｎｉ Ｐ Ｖ．Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ ｐｆｌａｎｚｅｎ ｋｒａｎｋｅｈｉｔｅｎ ａｎｄ ｐｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕ Ｐｙｔｈｉｕｍｈｉｍｕｍｉｎａｐｅ ａｔ ｐｅｒｌｉｔｅｍｉｘｔｕｒｅ．【ＪＪ．ｐｌａｎｔ ｓｏｉｌ，１９９３，１４８：１～６． ［１９］Ｂａｉｌｅｙ Ｂ Ａ，Ｌｕｍｓｄｅｎ Ｒ Ｄ．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ．【Ｊ１．１９９８， ２：ｌ ８５～２０４ …．９９９，１０６（６）：５８ｌ～５８９． （王霄编，张桂林校）