晚期糖基化终产物通过氧化应激引起人骨髓间充质干细胞凋亡

［3949（2011）19-05-0399-06文章编号］1007-

中国动脉硬化杂志2011年第19卷第5期399

·实验研究·

晚期糖基化终产物通过氧化应激引起人骨髓间充质干细胞凋亡

刘

钊，边云飞，肖传实

（山西医科大学第二医院心内科，山西省太原市030001）

［关键词］晚期糖基化终产物；［摘方法

要］目的

人骨髓间充质干细胞；

氧化应激；

细胞凋亡

观察不同剂量晚期糖基化牛血清白蛋白（AGE－BSA）对体外分离培养的人骨髓间充质干细胞

凋亡及氧化应激的影响，为临床上提细胞移植治疗糖尿病心肌病后供体干细胞的存活率提供新的依据。增殖、

采用全骨髓法从人的骨髓标本中分离培养骨髓间充质干细胞，以含10%FCS的L－DMEM培养细胞，

0.25%的胰酶消化后按1∶2比例传代接种培养，CD105和对第3代细胞应用流式细胞仪检测细胞表面标志CD44、CD34。在骨髓间充质干细胞中加入不同浓度的AGE－BSA，8溶液，37℃5%CO2培养箱培养作用24h后加入CCK-1h，用酶标仪在450nm处测定吸光度值。采用AnnexinV/PI双染法进行染色，避光作用20min后，将细胞置于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。同时对细胞内活性氧水平进行测定，并且测定细胞内的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。结果

传代后的骨髓间充质干细胞呈鱼群样或漩涡状排列，细胞为长梭形，贴壁紧密，形态较为一致。细

胞表面标志CD105（间充质干细胞相对特异性标志）及CD44（黏附分子，基质细胞表达）呈阳性表达，阳性率分别为98.9%、97.8%；CD34（造血干细胞/祖细胞及内皮细胞阳性）呈阴性表达，表达百分率为0.8%。与对照组相比，20、50、100和200mg/LAGE-BSA均不同程度地抑制骨髓间充质干细胞的增殖，促进其凋亡，随着作用浓度的增加，细胞内活性氧含量、丙二醛含量明显增加，而细胞匀浆中超氧化物歧化酶的活性却受到了抑制，具有剂量依赖效应。结论

晚期糖基化终产物通过促进骨髓间充质干细胞内活性氧生成、减少抗氧化酶生成，增强氧化应激，破坏

［文献标识码］

A

细胞内环境稳定性，从而抑制骨髓间充质干细胞增殖，促进细胞凋亡。［中图分类号］R363

AdvancedGlycationEndProductsPromotesApoptosisofHumanMesenchymalStem

CellsThroughOxidativeStress

LIUZhao，BIANYun-Fei，andXIAOChuan-Shi

（TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuan，Shanxi030001，China）［KEYWORDS］AdvancedGlycationEndProducts；［ABSTRACT］

Aim

MesenchymalStemCells；

OxidativeStress；

Apotosis

Toinvestigatetheeffectsofadvancedglycationendproducts（AGE-BSA）onoxidativestress

Methods

Thea-

andapoptosisinhumanbonemarrowderivedMesenchymalstemcells（hMSC），providingnewevidencesforahighersur-vivalofdonorMSCintheheartofdiabetescardiomyopathyafterclinicalstemcelltransplantation．passagedforsubsequentpassages．

dulthMSCwereisolatedfromadultbonemarrowandculturedinL-DMEMwith10%FCS，weresuspendedbytrypsinand

Atthethirdpassage，hMSCwereidentifiedastheimmunophenotypeofcellsurface

Then，hMSCwereculturedintheabsenceorpresenceofAGE-BSAfor24hours．

CD44，CD105，CD34onflowcytometry．

CCK8wereusedtoevaluatetheproliferationcapability，reactivatedoxygenspecies（ROS）wereanalyzedusingtheROSassaykit，thecontentofmalondialdehyde（MDA），theactivityofsuperoxidedismutase（SOD）weremeasured；thecellapotosiswasdetectedbyAnnexinV/PIflowcytometry．cells．

Results

ThehMSCexhibitedadherentlongspindle-shaped

TheimmunophenotypeofhMSCshowedthatbothstromalcell-associatedmarkers（CD44）andthestemcell-associ-Comparedwiththecontrolgroup，co-culturingwith20，50，100，200

Simultaneously，AGE-

associatedmarkeratedmarker（CD105）werepositive，whichwere97.8%and98.9%，whilebloodcell，endothelialcell-（CD34）wasnegative，whichwasonly0.8%．

mg/LAGE-BSAincreasedROSproduction，thecontentofMDAincellsandtherateofapoptosis．

［01-24收稿日期］2011-［E-mail为liuz3362619@163．com。边云飞，作者简介］刘钊，硕士研究生，博士，硕士研究生导师，主要研究方向为心血管疾E-mail为huiyuyang@yahoo．com．cn。通讯作者肖传实，病基础与临床，博士，教授，博士研究生导师，主要研究方向为心血管疾E-mail为yhy0603@sohu．com。病基础与临床，

400ISSN1007-3949ChinJArterioscler，Vol19，No5，2011

BSAdecreasedantioxidaseandproliferationofthecells．sion

Bothofthemwereinadosedependentmanner．

Conclu-

AGEincreasestheproductionofROSinhMSC，whileweakenstheproductionofantioxidases，itincreasestheoxida-

tivestress，breaksthehomeostasisofcells，accordingly，AGEinhibitstheproliferationofhMSCandincreasestheapoptosisofthesecells．

DM）发病率的逐随着糖尿病（diabetesmellitus，

年增高，糖尿病心肌病已成为老年DM患者死亡的又一主要原因。骨髓间充质干细胞（mesenchymal

MSC）移植治疗冠心病心肌梗死、stemcells，糖尿病心肌病等疾病已成为近年研究热点

［1，2］

程有限公司。

1.2人骨髓间充质干细胞分离、培养及形态学观察10%将骨髓按1500r/min离心5min，弃上清，FCS的L-DMEM培养基悬浮细胞，计数，将细胞密

92

度调至2×10/L，接种于25cm培养瓶中。置于37℃、5%CO2条件下培养。72h后半量换液，6天。然而，体

内的各种病理微环境削弱了移植后MSC的存活能

力，从而影响最终治疗效果，为干细胞治疗带来了新的难题

［3，4］

。晚期糖基化终产物（advancedglycation

endproducts，AGE）广泛存在于糖尿病患者体内，参与多种慢性并发症的发生。AGE不但与肽链或蛋白交联对细胞、

组织形成不可逆损伤，而且可与细胞表面AGE受体（receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE）相结合，通过其受体介导氧化应激促进细胞损伤

［5］

。已有研究证实AGE引起的氧化

应激与糖尿病心肌病密切相关［6］

。本文通过观察

不同浓度AGE-BSA作用后人MSC增殖、凋亡以及

氧化应激指标的变化，

进一步探讨其机制，以证实糖尿病病理微环境对MSC生存的抑制作用，从而为今

后减少移植后供体干细胞的损伤、提细胞移植治疗心肌疾病的疗效提供新的依据。

1

材料与方法

1.1

主要材料

成人骨髓标本来源于5例年龄为18～60岁的

健康志愿者的捐赠（均无糖尿病、高血压等疾病）。

标本的采集获取符合伦理学标准。无菌条件下骨髓穿刺抽取5mL骨髓液，

20kU/L肝素抗凝，所有标本取后立即分离。晚期糖基化终产物牛血清白蛋白（AGE-BSA）购自美国Biovision公司；牛血清白蛋白（BSA）购自美国Amresco公司；L-DMEM培养基购

自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；wst-8检测试剂盒（cellcountingkit-8）购自南京凯基生物科技发展有限公司；膜联蛋白V（AnnexinV）/碘化丙啶（propidiumiodide，PI）（An-nexinV/PI）双染色试剂盒购自北京四正柏生物技术有限公司；活性氧（reactiveoxygenspecies，

ROS）检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；超氧化物岐化酶（superoxidedismutase，

SOD）测试盒、丙二醛（malondialdehyde，

MDA）测试盒购自南京建成生物工程研究所；PBS缓冲液购自博士德生物工

后全量换液，尽量弃去未贴壁的细胞（包括血细胞、成纤维细胞等），此时细胞尚混有少量未贴壁的细胞，每隔2～3天换液，逐渐弃净未贴壁细胞。原代细胞长至80%～90%汇合时，将培养瓶中原培养基用吸管吸出，加入少量PBS洗1～2次，以洗净死细胞和残留的培养基。加入0.25%的胰酶消化。37℃孵育大约2～3min，当显微镜下80%～90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，加入含小牛血

清的L-DMEM培养基终止消化。用吸管反复吹打瓶底，

使所有细胞完全脱离瓶底，按1∶2比例传代接种培养。倒置相差显微镜下观察MSC形态。1.3人骨髓间充质干细胞的鉴定

0.25%胰酶消化收集第3代成人MSC，使每例

样本细胞数为3×105

个，以PBS缓冲液制备单细胞悬液，分别与FITC标记的CD34和PE标记的CD44及CD105常温下避光孵育30min；PBS洗涤2次后，再加入500μLPBS重悬细胞，用于FACS分析。1.4实验干预与分组

取3～4代培养的hMSC，随机分组进行实验。正常对照组：细胞不加干预措施正常培养；BSA对照组：培养液中加入终浓度为100mg/L的BSA培养24h；AGE-BSA组：培养液中分别加入终浓度为20、

50、100和200mg/L的AGE-BSA培养24h。1.5

CCK-8试剂盒评估细胞增殖能力

取生长状态良好的hMSC，0.25%胰酶消化，计

数后调整细胞浓度至2×106

个/L，按每孔100μL

（2×107

/L）接种于96孔培养板，每组设5个复孔和空白对照。按照实验分组加入不同的干预，干预前先用无血清DMEM培养基培养24h，使细胞达到同

步化，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃5%CO2培养箱培养1h，酶标仪在450nm处测定吸光度（OD）值。细胞存活率=加药组OD值/对照组OD值×

100%，抑制率=1－存活率。1.6

流式细胞术检测细胞凋亡率

采用AnnexinV/PI双染法，将贴壁细胞用

CN43-1262/R中国动脉硬化杂志2011年第19卷第5期401

0.25%胰酶消化，吹打成单细胞悬液，收集到离心管1000r/min离心5min后，内，弃去上清液，用PBS洗涤两次，用10μLAnnexinV和5μLPI进行染色，避光作用20min后，将细胞置于激发光为488nm波长的流式细胞仪检测，上机测定时获取1×105个以上细胞，重复两次。1.7

细胞内活性氧水平测定

以DCFH2DA作为荧光探针对细胞内ROS进行荧光标记，在荧光显微镜下观察细胞内ROS产生，并用流式细胞仪检测每组细胞内的平均荧光强度。设置未加DCFH2DA的阴性对照组和加阳性药物H2O2的阳性对照组。在处理好的hMSC中加入DCFH2DA荧光探针（用无血清培养基以1∶1000稀释），在37℃含5%CO2的培养箱中孵育30min，弃PBS冲洗后在荧光显微镜下观察细胞内去培养液，

荧光强度。PBS洗2次，用胰酶消化，加血清终止反PBS洗2次后用流式细胞仪检测细胞内ROS。应，

其中阳性对照组加100μmol/L的H2O2（试剂盒提供），常温下孵育1h后再加入荧光探针。

1.8细胞内丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性测定实验终止时，收集各组细胞，经超声破碎细胞后离心取上清液，按照MDA和SOD试剂盒说明书进行测定。1.9

统计学处理

数据以x±s表示，各组资料行单因素方差分析，干

t检验，预组与对照组之间比较采用Dunnett-各干预组q检验。检验水准为α=0.05。之间比较采用SNK-

～20天时，细胞汇流达80%，呈鱼群样或漩涡状排

列，细胞长梭形，贴壁紧密，形态较为一致，核呈椭圆形，可见1～2个核仁。此时以1∶2比例进行传代培

24h内完全贴养，传代细胞刚接种时为圆形，较大，7天即铺满培养瓶壁，伸展成梭形，开始迅速增殖，

底，传代细胞保持原代细胞的形态特征。随代数增

图1.第3代人骨髓间充质干细胞（×200）

Figure1.Morphologialcharacteristicsofhumanmesenchy-malstemcellsinthethirdpassage

加，细胞得到纯化，梭形细胞达95%以上（图1）。2.2人骨髓间充质干细胞的表面标志

对第3代hMSC的表面标志进行测定，发现CD105（间充质干细胞相对特异性标志）及CD44（黏附分子，基质细胞表达）呈阳性表达，阳性率分别为98.9%和97.8%；CD34（造血干细胞/祖细胞及内皮细胞阳性）呈阴性表达，表达百分率为0.8%（图2）。说明本实验培养的细胞具备MSC的表面标记特点，且细胞纯度较高。

2.3AGE对人骨髓间充质干细胞增殖的影响BSA对照组细胞OD450值差与正常对照组相比，

BSA作用后，细胞异无显著性。而不同浓度的AGE-OD450值发生改变，BSA浓度增加，OD450值且随AGE-显著降低（P＜0.05），同时细胞存活率降低（P＜

0.05），增殖抑制率增大（P＜0.05；表1）。

2

2.1

结果

人骨髓间充质干细胞的形态学观察

接种6天后可见散在生长、分布不均、纺锤形、

成纤维细胞样的单个贴壁细胞即为hMSC，大约第8～12天时可见单个细胞形成的多个细胞克隆，约13

n=15）表1.AGE对人骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用（x±s，

Table1.TheinhibitionoftheproliferationofhMSCbyAGEindifferentgroups分

组

OD值0.677±0.0450.661±0.0370.621±0.034a0.566±0.033b0.497±0.013c0.447±0.026d

97.73%±1.00%91.80%±1.61%a83.63%±1.55%b73.60%±3.03%c66.16%±2.11%d

2.27%±1.00%8.20%±1.61%a16.37%±1.54%b26.40%±3.03%c33.84%±2.11%d

细胞存活率

细胞抑制率

正常对照组BSA对照组

20mg/LAGE-BSA组50mg/LAGE-BSA组100mg/LAGE-BSA组200mg/LAGE-BSA组

a为P＜0.05，BSA组比较；c为P＜0.05，BSA组比较；d为P与正常对照组和BSA对照组比较；b为P＜0.05，与20mg/LAGE-与50mg/LAGE-＜0.05，BSA组比较。与100mg/LAGE-

4022.4

ISSN1007-3949ChinJArterioscler，Vol19，No5，2011

AGE对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

0.05）；AGE-BSA组随药物浓度（20、50、100、200

mg/L）的增加，细胞凋亡率也明显增加（分别为9.50%±0.92%、13.73%±1.07%、18.50%±0.82%和24.77%±1.11%），差异有显著性（P＜0.05；图3）。

正常对照组细胞集中在B3区，在B4区和B2区内无分布或分布甚少，凋亡率极低（2.33%±0.80%）；BSA对照组细胞凋亡率（4.13%±0.70%）与正常对照组相比差异无显著性（P＞

2.5AGE对细胞内活性氧产生的影响

20、50、100和200mg/随着AGE作用浓度（0、

L）的增加，细胞内活性氧强度亦逐渐增加，差异有统计学意义（P＜0.01；表2和图4）。

n=6）表2.活性氧平均荧光强度的比较（x±s，Table2.ComparisonofROSindifferentgroups分

组

ROS5.62±2.19a121.45±3.06a19.30±3.0121.53±2.8654.20±2.09a84.63±2.86b95.60±3.02c101.65±3.d

图4.荧光显微镜观察各组细胞内活性氧的荧光强度

A为正常对照组、B为阳性对照组，C～F分别为20、50、100及200mg/LAGE-BSA组。

阴性对照组阳性对照组正常对照组BSA对照组

20mg/LAGE-BSA组50mg/LAGE-BSA组100mg/LAGE-BSA组200mg/LAGE-BSA组

a为P＜0.05，与正常对照组和BSA对照组比较；b为P＜0.05，与20mg/LAGE-BSA组比较；c为P＜0.05，BSA组比较；与50mg/LAGE-d为P＜0.05，BSA组比较。与100mg/LAGE-

Figure4.ROSfluorescenceintensityunderfluorescentmicroscopyindifferentgroups

CN43-1262/R

2.6

中国动脉硬化杂志2011年第19卷第5期403

AGE对骨髓间充质干细胞超氧化物歧化酶活

性及丙二醛含量的影响

BSA对照组细胞匀浆中与正常对照组相比，

SOD的活性和MDA含量差异无统计学意义，而不BSA作用后，同浓度AGE-细胞匀浆中SOD活性随

MDA含量则随药物浓度增药物浓度的增高而降低，

高而增高，差异有统计学意义（P＜0.05；表3）。

n=6）表3.超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量（x±s，Table3.ThelevelsofSOD，MDAindifferentgroups困扰我们的问题。移植到糖尿病心肌病患者体内

MSC面对着一个引起细胞损伤和凋亡的多因素后，

复杂微环境，其中，氧化应激是一个重要影响因素。AGE是蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶参与的条件下自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定的共价化合物。在糖尿病患者体内，慢性高血糖加速了糖和蛋白质之间的反应，导致AGE的形成，并且与许多大分子化合物形成不可逆的交联。这些AGE以极快的速度在组织间积聚，参

AGE与多种慢性并发症的发生。在糖尿病患者中，分

组

SOD（kU/L）MDA［μmol/（L·g）］

正常对照组36.51±1.055.60±0.23BSA对照组

35.85±1.01

6.06±0.1420mg/LAGE-BSA组30.76±0.79a7.83±0.17a50mg/LAGE-BSA组28.16±1.05b10.47±0.26b100mg/LAGE-BSA组25.82±0.86c13.59±0.32c200mg/LAGE-BSA组23.17±1.04d

15.82±0.19d

a为P＜0.05，与正常对照组和BSA对照组比较；b为P＜0.05，与20mg/LAGE-BSA组比较；c为P＜0.05，与50mg/LAGE-BSA组比较；d为P＜0.05，与100mg/LAGE-

BSA组比较。3讨论

MSC是一种从骨髓中分离获得的成体干细胞，具有易于获取、分离方便、多向分化潜能和无免疫反

应等特点，在细胞移植和基因治疗方面具有良好的应用前景。近年来，基础研究发现，

MSC可以在心肌微环境中分化为心肌细胞和血管内皮细胞［7］

。同时它们可以释放促进血管生成和抗凋亡的因子，如血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepaticgrowthfac-tor，HGF）和胰岛素样生长因子（insulinlikegrowth

factor，IGF-1）等，从而激活内源性的修复机制［8］。

在缺血性心脏病和扩张型心肌病的大鼠模型中也发

现，MSC移植能够抑制心肌纤维化、降低基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP-2和MMP-9）的表达。因此，骨髓干细胞移植治疗心血管疾病已成为当今研究热点

［9，10］

。MSC移植在改善糖尿病心肌病心脏功能和血管新生方面具有巨大潜力。然而，治疗效果却被移植后细胞的低存活率大大。因此，移植后细胞的存活成了细胞治疗成败的关键。我们需要寻找到那些将会抑制糖尿病心肌病微环境中供体细胞存活的因素，以及他们是如何引起细胞凋亡的，从而解决

不但可以硬化胶原蛋白骨干结构，而且可以与不同

细胞表面的AGE受体（RAGE）结合，刺激成纤维生长因子释放，促进胶原蛋白的沉积，增加炎症反应，

引起氧化应激，最终导致组织纤维化

［11，12］

。Kume等［13］研究认为，体外制备的AGE与MSC共同培养的过程中会对细胞增殖和凋亡状况产生一

定程度的影响，其作用是通过RAGE介导的。表明AGE作为糖尿病患者体内的病理微环境有可能通过RAGE对MSC产生影响。

本研究选取不同浓度的晚期糖基化终产物牛血

清白蛋白（AGE-BSA）作为细胞生存的病理微环境，并以100mg/L牛血清白蛋白作用组为对照，利用全

骨髓法体外分离培养hMSC，不断传代纯化后，对贴壁的MSC用流式细胞术鉴定其细胞表型，并且观察MSC在药物作用24h后的增殖、凋亡状况及细胞内ROS产生量、SOD活性和MDA含量的变化。研究

发现，与正常对照组相比，20、50、100和200mg/LAGE-BSA均不同程度地抑制MSC的增殖，且随着

浓度的增加，抑制作用更加明显；同时，20、50、100和200mg/LAGE-BSA具有促进MSC凋亡的作用，随着药物作用浓度的增加，凋亡率明显增大，两者均呈剂量依赖性变化。随着AGE作用浓度的增加，

细胞内活性氧含量及MDA含量明显增加，而细胞匀浆中抗氧化酶SOD的活性却受到了抑制，同样具有剂量依赖效应。

综上所述，

AGE可以通过促进MSC内活性氧生成、减少抗氧化酶生成，增强氧化应激，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。糖尿病病理微环境对MSC生存的抑制作用是通过氧化应激诱导细胞凋亡产生的。这为今后减少移植后供体干细胞的损伤、提细胞移植治疗心肌疾病的疗效提供了新的依据。

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许雪梅）

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