顶空气相色谱法测定齐拉西酮中残留溶剂
Determination of residual solvents in an antithrombotic drug Ziprasidone by
headspace GC
摘要 目的 建立测定齐拉西酮残留溶剂的顶空毛细管气相色谱法。方法 采用程序升温法，FID检测器，色谱柱为DB-624毛细管柱（30.0m×0.53mm,df=3.0µm）,载气为氮气，进样口温度为250℃，柱温50℃，保持8min，以10℃/min的速度升到150℃，再以50℃/min的速度升到200℃保持6 min，检测器温度250℃，顶空温度为100℃。结果 在该条件下甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯及二甲苯的浓度与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999，平均回收率在95%-105%之间，RSD﹤3%，符合药典规定。 结论 所用顶空气相色谱法简便、准确、灵敏度高，适用于本药物残留溶剂的测定。
关键词 顶空气相色谱法 残留溶剂 毛细管柱
Abstract Objective To develop the headspace capillary gas chromatography method for the determination of residual solvent in Ziprasidone. Methods The samples were injected by headspace sampler with program heating and FID detector. The determination was performed on DB-624 GC column (30m×0.53mm, 3.0μm),with nitrogen as carrier gas The injection port temperature was 250 ℃ and the detector temperature was 250 ℃.The oven temperature was beginning from 50 ℃, after maintaining 8 min, the temperature was programmatically increased to 150℃ at the rate of 50 ℃/min and increased to 200℃ at the rate of 10 ℃/min maintained for 6 min. The headspace temperature was 100 ℃. Results Under this experimental condition, there was the good linear relationship between the experimental concentrations of solvent with the peak area. The regression coefficients were between 0.999 and 0.9999.The recoveries were between 95% and 105% with RSD less than 3%. Conclusion The method is simple, accurate and sensitive with good reproducibility. It can be used for
the determination of the residual organic solvents in an antithrombotic drug Y19.
Ker words Headspace gas chromatography Residual solvents Capilary column
药物中的残留溶剂是指在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽[1]。近年来，药品中残留有机溶剂的毒性和致癌作用日益引起各方面的重视 [2]。
20世纪 90年代，残留溶剂的毒性及致癌作用开始引起国际医药界和管理部门的关注和重视。我国药品中残留有机溶剂检测也越来越受到有关方面的重视。 为了防止长期接触化学品后可能对人体健康和对整个环境造成危害，国际化学品安全性纲要（IPCS） 、美国环境保护机构（EPA）和 FDA等机构规定了残留溶剂可接受的接触水平，研究和控制残留溶剂的水平。
在齐拉西酮样品制备过程中，使用了甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯及二甲苯，因此，需要对这10种溶剂的残留情况做相关的研究考察。目前，检测药物中的残留溶剂的方法有气相色谱法、高效液相色谱法等方法。本文采用顶空气相色谱法检测药物中的残留溶剂，该法具有柱效高、选择性较好、检测灵敏度高、分析时间短等优点。针对具体的药物，要考虑药物和待测溶剂的性质，选择可行性的检测方法。
1、仪器与试药
Agilent 60N型气相色谱仪；Agilent 7694E顶空进样器； BP211D型电子分析天平；
甲醇、四氢呋喃（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），无水乙醇、二甲苯（色谱纯，天津市试剂二厂），乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、丙酮（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司），甲苯（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）、乙腈（色谱纯，Fisher Scientific） 2 色谱条件
色谱柱：DB-624（30.0m×0.53mm，df=3.0μm）石英毛细管柱，固定相为6%氰丙基苯
基-94%二甲基聚硅氧烷；气化室温度为250℃，柱室温度为50℃，保持8分钟，以
10℃/分升温至150℃，再以50℃/分升温至200℃，保持6分钟；检测器为FID氢火焰离子化检测器，温度为250℃；顶空平衡温度为100℃，平衡时间为35min；
载气为高纯氮气，恒压2.50psi；氢气流速为40ml/min；空气流速为450ml/min；尾吹：30ml/min；进样量为3mL，不分流进样。 3 试验与结果
3.1系统适用性试验
取甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲
苯及二甲苯适量用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）稀释进样，记录气相色谱图（见图1），同法记录空白溶剂DMF的气相色谱图（见图2）。在此气相色谱条件下，10种有机溶剂峰分离效果良好，且溶剂DMF对待测组分无干扰，分离度符合要求，理论板数按各峰计算不小于10000。
甲醇 乙醇
丙酮
四乙腈
氯甲烷 二正酸己乙烷 酯
喃 呋甲苯 乙氢二甲苯
图1 标准溶液GC色谱图
图2 DMF空白溶液GC色谱图
3.2 溶液的配置
3.2.1 标准溶液 分别精密称取甲醇150 mg、乙醇250 mg、丙酮250 mg、乙腈20 mg、二氯甲烷30 mg、正己烷15 mg、乙酸乙酯250 mg、四氢呋喃36 mg、
甲苯44 mg及二甲苯108mg，置50ml量瓶中，用N,N-二甲基乙酰胺溶解并稀释至刻度，摇匀，即得标准储备液。
精密量取标准储备液5.0ml，置50ml量瓶中，用N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，即得相应的标准溶液（参照2010年版《中国药典》二部附录规定的残留溶剂限度）。
3.2.2 供试品溶液 精密称取齐拉西酮样品约200mg，置于顶空气相瓶中，加2.0ml N,N-二甲基乙酰胺溶解，密封，得100mg/ml的样品溶液。 3.3 方法学考察
3.3.1 线性关系考察 分别精密量取标准储备液一定量，用N,N-二甲基乙酰胺依次稀释成不同浓度比例的标准曲线溶液（为测定浓度的200%，150%，100%，50%，20%和10%），充分摇匀。精密量取2.0ml置顶空进样瓶中，密封，按浓度从低到高依次测定，测定结果见表1-1。
表1-110种溶剂线性关系试验结果
甲醇浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程 乙醇浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程 丙酮浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程 乙腈浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程
二氯甲烷浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程
正己烷浓度(mg/ml)
0.03 75.8
0.06 151.2
0.15 392.3
0.3 803.7
0.45 1222.9
0.6 1638.8
Y=2748.2x(mg/ml)-14.149 R=0.9999 0.05 191.7
0.1 376.2
0.25 957.6
0.5 1919.7
0.75 2884.3
1 3786.2
Y=3804.5x(mg/ml)+5.83 R=0.9999 0.05 457.7
0.1 903.1
0.25 2266.4
0.5 4492.0
0.75 6795.9
1 8865.3
Y=04.1x(mg/ml)+30.738 R=0.9999 0.0041 12.7
0.0082 24.8
0.0205 63.6
0.041 128.5
0.0615 193.1
0.082 252.9
Y=3105.4x(mg/ml)+0.1328 R=0.9999 0.006 17.9
0.012 31.3
0.03 76.2
0.06 149.2
0.09 223.3
0.12 2.2
Y=2402.3x(mg/ml)+3.8637 R=0.9998 0.003
0.006
0.015
0.03
0.045
0.06
面积积分值 线性方程
乙酸乙酯浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程
四氢呋喃浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程 甲苯浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程
二甲苯浓度(mg/ml) 面积积分值 线性方程
178.1 355.0 872.1 1742.1 2683.0 3478.9
Y=58409x(mg/ml)+3.6829 R=0.9998 0.05 302.2
0.1 590.3
0.25 1466.9
0.5 2925.8
0.75 4453.8
1 5773.9
Y=5810.3x(mg/ml)+19.258 R=0.9998 0.0072 77.9
0.0144 154.3
0.036 383.3
0.072 761.0
0.108 1165.9
0.144 1517.2
Y=10597x(mg/ml)+2.6069 R=0.9998 0.0088 57.0
0.0176 110.7
0.044 277.6
0.088 558.9
0.132 839.5
0.176 1091.8
Y=6241.2x(mg/ml)+4.0998 R=0.9998 0.0216 72.4
0.0432 149.9
0.108 350.4
0.216 685.9
0.324 1033.7
0.432 1363.9
Y=3142.6x(mg/ml)+9.7594 R=0.9999
3.3.2 最小检出 分别精密量取甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯及二甲苯适量逐步稀释，按上述色谱条件进行测定，记录S/N=3时浓度分别为0.57 、0.39、0.11、0.37 、0.36、0.0074、0.11、0.06、0.08、0.16μg/ml，相应的峰面积为1.2、1.4、1.0、1.5、1.2、1.3、1.1、1.1、1.2、1.3。 3.3.3 精密度试验 精密量取标准溶液2ml，共6份，分别置顶空进样瓶中，密封，按上述色谱条件进样测定，结果甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯及二甲苯峰面积的RSD分别为2.02%、1.13%、1.06%、1.08%、0.93%、0.98%、1.09%、1.055%、0.99%、1.03%（n=6）结果良好，符合规定。
3.3.4 样品重复性试验 取100325批样品六份，各约200mg，精密称定，置顶空进样瓶中，加DMF2ml溶解，密封，进样测定，结果乙醇、丙酮和乙酸乙酯峰面积的RSD分别为1.5%、1.8%和2.0%，其它溶剂未检出。
3.3.5 回收率试验 精密称取100325批样品约200mg，共6份，分别置于顶空进样瓶中，各精密加入2ml标准溶液，密封，进样测定（见表2）。
表2 回收率试验结果
溶剂 平均回收率（%） RSD（%） 甲醇 100.3 1.5 乙醇 101.5 2.0 丙酮 98.3 1.6 乙腈 97.8 2.2 二氯甲烷 102.3 2.1 正己烷 101.8 2.3 乙酸乙酯 98.2 1.5 四氢呋喃 97.4 1.2 甲苯 99.1 1.3 二甲苯 96.5 2.5
3.4 样品的测定
取三批样品，依法制备供试品溶液，每批2份，按上述条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算6中溶剂含量（见表3）。
公式：残留量（%）=
As200L(%)
AWAs为样品中测得残留溶剂峰面积；L为溶剂残留限度；A为标准溶液峰面积；W为样品的称样量(mg)。
批号
乙醇(%)
丙酮(%)
乙酸乙酯(%)
20120112 20120114 20120116
0.0382，0.0394 0.0503，0.0491 0.0307，0.0297
0.0039，0.0040 0.0068，0.0065 0.0020，0.0016
0.0057，0.0051 0.0074，0.0077 0.0046，0.0051
结果表明，乙醇、丙酮及乙酸乙酯残留量不超过限度标准；乙醇限度为5.0% ，丙酮为0.5%，乙酸乙酯为0.5%。其他溶剂未检出。
图2 样品气相色谱图
4 讨论
4.1 溶媒的选择 根据样品和待测溶剂的溶解度，选择合适的溶媒，如果样品不能完全溶解，将影响检测结果的准确度，因此，要选择一种既能完全溶解样品又不干扰测定的空白溶媒。样品水溶性差，本课题考察了溶剂N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）及N,N-二甲基乙酰胺，由于DMSO与样品发生反应，DMF与二甲苯分离情况较差，故最终选择用N,N-二甲基乙酰胺作为溶媒。
4.2色谱柱的选择
气相色谱法的流动相一般为氮气、氦气和氢气，由于流动相的选择比较少且对样品的分离影响较小，故色谱柱的选择对分离起着至关重要的作用。气相色谱柱分为填充柱和毛细管柱。
填充柱的价格便宜，但是分离效率低，目前已逐步被毛细管柱所取代。 毛细管柱的柱效和灵敏度均比填充柱高。根据极性强弱，毛细管柱可以分为非极性、弱极性、中等极性和极性四种类型。非极性毛细管柱，固定相为100%的二甲基聚硅氧烷的色谱柱，例如HP-1等；弱极性毛细管柱，固定相为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，例如HP-5、SE-52等；中等极性毛细管柱，固定相为6%-氰丙基苯－94%-二甲基硅氧烷共聚物，例如DB-624等；极性毛细管柱，固定液为聚乙二醇（PEG-20M）的毛细管柱，例如 DB-WAX等。
本试验分别选用DB-624、 HP-5、HP-InnoWax毛细管柱分离上述标准溶液，考察各溶剂峰的分离情况，DB-624毛细管柱的分离效果最好。
4.3 顶空温度的考察
本文采用顶空进样法，顶空进样法可以允许气化室在较低温度下操作，避免了样品在高温下产生挥发性热分解产物而干扰测定，而且顶空进样可以相对减少用于溶解样品的沸点较高的溶剂（如二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺）的进样量，避免其干扰其它组分的测定。
分别考察顶空温度为90℃、100℃、110℃时，标准溶液中10种溶剂的分离情况，90℃时，标准溶液的各溶剂峰分离较差，灵敏度较低；100℃时，分离情况较好；110℃时，标准溶液中各溶剂峰稍有分解，影响测定。综合考虑，选择顶空温度为100℃。
4.4程序升温的考察
对于气相色谱法来说，温度是一个重要参数，其直接影响色谱柱的选择分离、检测器的灵敏度。主要是控制色谱柱、气化室、检测室的温度。色谱柱的温度控制方式有恒温和程序升温二种。
对于沸点范围较宽的混合物，一般选用程序升温法进行测定。程序升温指在一个分析周期内柱温随时间由低温向高温作线性或非线性变化。程序升温不仅可以缩短分析时间，还可以提高分离效率。
4.5载气压力
分别选择载气压力为2.5psi、3.0psi、3.5psi，考察标准溶液中各溶剂的分离情况差别不大，因此选择载气压力为2.5psi。
本试验所建立的方法能有效检出齐拉西酮中的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯及二甲苯的残留量。为控制本品的残留溶剂提供可靠的测定方法。
参考文献
[1] Zhou H J .Technical Requirements for Registrations of Pharmaceuticals of Human
Use (药品注册的国际技术要求) [M]. Beijing:People.Medical Publishing House , 2006 .
[2] 化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则Q3C杂质.化学药物有机溶剂残
留量研究技术指导原则课题研究组[H]. 2004, 12-16.