(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105181694 A (43)申请公布日 2015.12.23
(21)申请号 201510090103.6(22)申请日 2015.02.27
(71)申请人北京利德曼生化股份有限公司
地址100176 北京市大兴区北京经济技术开
发区兴海路5号(72)发明人谭谨
(74)专利代理机构北京康思博达知识产权代理
事务所(普通合伙) 11426
代理人刘冬梅 路永斌(51)Int.Cl.
G01N 21/82(2006.01)G01N 33/574(2006.01)G01N 33/543(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图2页
(54)发明名称
癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用(57)摘要
本发明公开了癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用。本发明试剂盒包含以下各成分：癌胚抗原，R1试剂、R2试剂和校准品。所述R1试剂包括以下各成分：MOPS缓冲液，BSA，表面活性剂和防腐剂；所述R2试剂包括以下各成分：PBS缓冲液，CEA抗体包被的胶乳微球，BSA，表面活性剂，海藻糖和防腐剂；本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒线性良好，精密度高，准确性可靠，相关性良好，可以应用于癌胚抗原检测，能够在全自动生化分析仪上使用，使用方便快捷，成本低。 C N 1 0 5 1 8 1 6 9 4 A CN 105181694 A
权 利 要 求 书
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1.一种癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包含以下各成分：癌胚抗原，R1试剂、R2试剂和校准品。
2.按照权利要求1所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的R1试剂包括以下各成分：MOPS缓冲液，BSA，表面活性剂，防腐剂；
优选的，各成分的用量为：
其中，所述的MOPS缓冲液的pH值优选为7-8。
3.按照权利要求1所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的R2试剂包括以下各成分：PBS缓冲液，CEA抗体包被的胶乳微球，BSA，表面活性剂，海藻糖和防腐剂；
优选的，各成分的用量为：
其中，所述的PBS缓冲液的pH值优选为7.4。
4.按照权利要求1所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的CEA抗体包被的胶乳微球通过下述方法制备得到：
(1)用MES缓冲液冲洗胶乳微球；(2)在活性缓冲液中重悬胶乳微球；(3)用MES缓冲液配制NHS4和EDC；(4)将NHS和EDC混合均匀，在室温下反应；
(5)用MOPS缓冲液冲洗反应产物并重悬在缓冲液中得到微球悬液；(6)溶解CEA单克隆抗体于MOPS缓冲液中，将微球悬液和CEA单克隆抗体单抗溶液混合，室温下反应；
(7)冲洗反应产物后重悬于试剂2缓冲液中，缓慢混合，超声使微球分散。5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中用MES缓冲液冲洗100nm胶乳微球两次。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中重悬胶乳微球，使微球浓度为
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权 利 要 求 书
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1％(wt％)，采用超声或者搅拌的方法确保微球重悬。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中用pH5.0的MES缓冲液配制NHS和EDC；其中，NHS或EDC的浓度优选为2.5mg/ml；步骤(4)中将NHS和EDC混合均匀，在18-25℃的室温下反应15分钟；步骤(6)中在18-25℃的室温下反应2-4小时 。
8.按照权利要求1所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述的校准品通过以下方法制备得到：将人癌胚抗原重组蛋白溶于稀释液中制成6个浓度的校准品；以市售化学发光试剂盒分别检测10次，求出平均值，以此定为校准品浓度。
9.按照权利要求8所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：其中，所述的稀释液的成分包括：NaCl 0.9％，BSA0.5％，防腐剂0.7％；稀释液的pH值为7.4。
10.权利要求1所述的癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒在制备检测癌胚抗原试剂中的应用。
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说 明 书
癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用
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技术领域
本发明涉及胶乳增强免疫比浊试剂盒，尤其涉及癌胚抗原(CEA)胶乳增强免疫比浊试剂盒，本发明还涉及该癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法和应用，属于癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒领域。
[0001]
背景技术
迄今为止，癌胚抗原(CEA)检测方法较多，包括酶联免疫吸附实验(ELISA)和化学
发光(CLIA)免疫分析法等。ELISA和化学发光法均采用双抗体夹心法，不同之处主要为标记物不同：ELISA为辣根过氧化物酶；化学发光法为AMPPD化学发光剂，其原理为样品、标记了碱性磷酸酶的大鼠抗CEA单抗以及包被了大鼠抗CEA另一位点单抗的磁性颗粒被一起加入到反应管中，样品中的CEA和固相在磁性颗粒表面的抗体以及游离的酶结合物在不同的抗原位点上同时发生反应，而后，反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗，去除未和固相结合的其他成分，最后在反应管中加入化学发光底物AMPPD，已与固相结合的碱性磷酸酶会使该底物发出光子并被光电比色计所检测，最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描述的光量子与标准品CEA的对应关系而计算出样品中的CEA浓度，反应产生的光子与样品中CEA的含量成正比。
[0003] 采用酶联免疫法检测癌胚抗原所存在的主要缺点是测定过程中需要进行洗涤分离步骤，耗时长，自动化程度不高，批间差和重复性相对较大。
[0004] 采用化学发光法检测癌胚抗原虽然灵敏度和线性都较高，但试剂成本相对较高且配套的大型仪器比较昂贵。[0005] 因此，亟待需要研发一种灵敏度高、特异性强，方便快捷，成本较低，可在全自动生化分析仪上使用的癌胚抗原检测试剂盒。
[0002]
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以在全自动生化分析仪上使用的癌胚
抗原(CEA)免疫增强比浊试剂盒，该试剂盒可在全自动生化分析仪上使用，具有灵敏度高、特异性强，方便快捷，成本较低等优点。[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：[0008] 本发明提供了一种癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，包含以下各成分：癌胚抗原，R1试剂、R2试剂和校准品。[0009] 其中，所述的癌胚抗原可以通过商业途径购买得到，也可按照本领域的常规方法制备得到(例如，通过基因工程的方法得到)。[0010] 所述的R1试剂包括以下各成分：MOPS缓冲液，BSA，表面活性剂，防腐剂，余量是水；
[0006]
优选的，各成分的用量为：
[0012] MOPS缓冲液0.01M-0.1M；
[0011]
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说 明 书
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BSA 0.1％-1％(wt％)[0014] 表面活性剂 0.5％-5％(wt％)
[0015] 防腐剂 0.05％-0.5％(wt％)；[0016] 其中，所述的MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲液的pH值优选为7-8。[0017] 所述的R2试剂包括以下各成分：PBS缓冲液，CEA抗体包被的胶乳微球，BSA，表面活性剂，海藻糖，防腐剂，余量是水。[0018] 优选的，各成分的用量为：
[0019]
[0020]
其中，所述的PBS缓冲液的pH值优选为7.4。
[0022] 本发明中所用到的表面活性剂优选为tween-20或者tritonX100；所述的防腐剂优选为叠氮钠。
[0023] 所述的CEA抗体包被的胶乳微球可参考以下方法制备得到：[0024] (1)用MES缓冲液冲洗100nm胶乳微球；[0025] (2)在活性缓冲液(15mM MES缓冲液；MES缓冲液成分：2-(N-吗啡啉)乙磺酸)中重悬胶乳微球；
[0026] (3)用MES缓冲液(pH5.0)配制NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(碳化二亚胺)；[0027] (4)将NHS和EDC混合均匀，在室温下反应；
[0028] (5)用pH7.0MOPS缓冲液冲洗反应产物并重悬在缓冲液(15Mm MES缓冲液)中得到微球悬液；
[0029] (6)溶解CEA单克隆抗体于MOPS缓冲液中，将微球悬液和CEA单克隆抗体单抗溶液混合，室温下反应；
[0030] (7)冲洗反应产物后重悬于试剂2缓冲液中，缓慢混合，超声使微球分散；储存在4℃直到使用。
[0031] 所述试剂2缓冲液的组成成分如下：
[0021] [0032]
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说 明 书
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优选的，步骤(1)中用MES缓冲液冲洗100nm胶乳微球两次；[0034] 步骤(2)中重悬胶乳微球，使微球浓度为1％(wt％)，采用超声或者搅拌的方法确保微球重悬良好；
[0035] 步骤(3)中用pH5.0的MES缓冲液配制NHS和EDC；其中，NHS或EDC的浓度优选为2.5mg/ml；
[0036] 步骤(4)中将NHS和EDC混合均匀，在18-25℃的室温下反应15分钟；[0037] 步骤(6)中在18-25℃的室温下反应2-4小时
[0033]
所述的校准品可通过以下方法制备得到：
[0039] 将人癌胚抗原重组蛋白溶于稀释液中(pH7.4，NaCl 0.9％，BSA0.5％，防腐剂0.7％)制成6个浓度的校准品；以市售化学发光试剂盒分别检测10次，求出平均值，以此定为校准品浓度。[0040] 其中，所述的稀释液的成分包括：NaCl 0.9％，BSA0.5％，防腐剂0.7％，余量是水；稀释液的pH值为7.4；
[0041] 本发明试剂盒的应用方法如下：在贝克曼AU400上定标检测样本，具体参数见表1。
[0042] 表1 检测参数
[0038] [0043]
本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒灵敏度高、特异性强，可在全自动生化
分析仪上使用，方便快捷，成本较低。[0045] 线性范围的评价实验结果表明，本发明试剂盒线性良好。试剂精密度测定结果，本发明试剂盒的CV分别为5.27％和3.21％，试剂精密度良好。将本发明试剂盒与市售化学发光法试剂进行相关性分析的结果可以看出本发明试剂盒准确性可靠，相关性良好，可以应用于癌胚抗原检测。
[0044]
附图说明
图1本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒的定标曲线。
[0047] 图2本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒的线性范围实验结果。
[0046]
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说 明 书
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图3本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒与化学发光法试剂盒相关性实验
结果。
具体实施方式
[0049] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。[0050] 实施例1癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备[0051] CEA单克隆抗体的制备
[0052] 将CEA抗原(购自hytest公司的抗原，Cat.#8CEA88mf)免疫兔子获得CEA单克隆抗体。具体方法是：兔子腹腔注射，免疫量为3mg每只，一个月免疫一次，共5次，之后收集免疫血清，用protein G纯化，最终保存在pH7.4的磷酸盐缓冲液中。抗体的效价通过酶联免疫吸附试验进行鉴定。[0053] R1试剂的组成：
[0054]
[0055] [0056]
R2试剂的组成：
[0057]
CEA抗体包被的胶乳微球按照下述方法制备得到：
[0059] 用10ml MES缓冲液冲洗100mg/ml胶乳微球(100nm)(购于Merck Millipore)两遍；第二次冲洗后，在10ml活性缓冲液中重悬微球，使微球浓度为1％，采用超声或者搅拌的方法确保微球重悬良好；用15mM MES缓冲液(pH5.0)配制NHS(2.5mg/ml)400μL，EDC(2.5mg/ml)400μL；分别加入350μL NHS和EDC，混合均匀；在室温(18-25℃)反应15分钟，持续混合；50mM MOPS缓冲液(ph7.0)冲洗两次并重悬在5ml缓冲液中。确保粒子像步骤2一样良好悬浮；溶解CEA单克隆抗体于5mlMOPS缓冲液中，将微球悬液和单抗溶液混合，室温反应2-4小时；冲洗，重悬于10ml试剂2缓冲液中，缓慢混合30分钟，超声使微球分散；储存在4℃直到使用。
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说 明 书
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校准品的制备
[0061] 将市售人癌胚抗原重组蛋白(购自hytest公司，Cat.#8CEA88mf)溶于稀释液中(pH7.4，NaCl 0.9％，BSA0.5％，防腐剂0.7％)制成6个浓度的校准品；以市售化学发光试剂盒(购自Roche)分别检测10次，求出平均值，以此定为校准品浓度。
[0062] 实验例1本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒线性范围的评价实验[0063] 1、实验方法[00] 线性：高值校准液按照1、3/4、1/2、1/4、1/8稀释5个浓度检测试剂线性。[0065] 2、实验结果
[0066] 试剂盒线性范围的评价实验结果见表1。[0067] 表1 试剂盒线性范围的评价实验
[0068]
[0069]
用接近线性上线的癌胚抗原高值样本(97.583)，用0.9％NaCl溶液稀释到1/8、
1/4、1/2、3/4共五个浓度梯度，每个浓度重复测定3次，计算平均值。利用软件计算回归方程为y＝105.33x-11.105，R2＝0.9916。实验结果表明，本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒具有良好的线性范围。
[0071] 实验例2本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒精密度评价实验[0072] 1、实验方法[0073] 精密度：用低值和高值样本测试试剂，重复测试至少10次，计算均值及变异系数。[0074] 2、实验结果
[0075] 试剂盒精密度的评价实验结果见表2。[0076] 表2 试剂盒精密度的评价实验结果
[0070] [0077]
精密度 12
CL3.513.
CH10.739.98
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34567101112131415均值SDCV％
[0078]
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3.853.684.014.053.873.533.623.573.3.523.483.533.55
10.9110.7610.2110.4510.7810.5410.4210.7210.951110.749.8710.54
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3.6866666710.57333330.194145.27％
0.3340933.21％
根据本发明试剂盒精密度实验结果可见，测试两个浓度水平样本，每个样本测15次，计算CV％。计算结果CV分别为5.27％和3.21％；实验结果表明，本发明试剂盒精密度良好。
[0079] 实验例3本发明癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒与化学发光法试剂盒相关性实验
[0080] 1、实验方法
[0081] 用试剂检测20例以上的病人(异常样本不少于5例)，用线性回归方法计算与对照结果的相关系数及每个浓度点的相对偏差。[0082] 2、实验结果
[0083] 试剂盒相关性的评价实验结果见表3。[0084] 表3 试剂盒相关性的评价实验结果
[0085]
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从相关性实验结果可见，本发明试剂盒与市售化学发光法试剂相关性较好：相关方程y＝0.9144x+0.9939，R2＝0.9139，从结果可以看出本发明试剂盒准确性可靠，相关性良好，可以应用于癌胚抗原检测。
[0086]
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