叶绿素含量的测定
一、 实验目的
1. 了解分光光度计的工作原理； 2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计；
3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度
法。
二、 实验原理
叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。
叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm，5nm有吸收峰，叶绿素a和叶绿素b的浓度符合以下公式：
Ca=0.0127A663-0.00259A5
Cb=0.0229A5-0.00467A663 浓度单位是：g/L
Ca=12.7A663-2.59A5
Cb=22.9A5-4.67A663 浓度单位是：mg/L
叶绿素总浓度为： CT=Ca+Cb 若以试液中色素含量来表示，则
C(mg/L)提取液总体积(ml)叶绿素含量（mg/g鲜样）
样品重(g)1000
三、 仪器、试剂和材料 1. 仪器
紫外-可见分光光度计、研体、25ml容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管 2. 试剂
丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮 2. 材料
滤纸、石英砂、碳酸镁 四、 操作步骤
1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g；
2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色；
3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。
4. 以80%的丙酮为参比液，在663和5nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。 五、 结果处理
按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。 六、 注意事项
1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。
2. 对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，仔细研磨后加入丙酮进行抽提。
3. 分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。 七、思考题
1. 当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？
附属实验：
1. 溶剂极性对有机物精细结构影响 苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水 2. 溶剂pH对光谱的影响
苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）