牛奶中三种细菌生物被膜特性探究

现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．Ｉ　牛奶中三种细菌生物被膜特性探究　周文渊，张宏梅，姜燕，黄慧嫦，陈胜华，廖丁妹，郭凯，张文艳，杨安林　（广东工业大学轻工化工学院，广东广州５１０００６）　摘要：生物被膜的形成给牛奶保藏和保鲜带来极大的隐患，探讨牛奶过程中生物被膜形成特性以及寻求有效的抑制生物被膜　的方法具有重要意义。本实验通过微孔板法模拟牛奶过程，研究食源性金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏茵和大肠杆菌在牛奶中生物　被膜形成能力、生物被膜中活菌数目与种间群体感应信号分ＡＩ．２活力三者之间的关系。随后利用ＡＩ．２抑制剂呋喃酮，检测三种细菌　生物被膜形成能力及ＡＩ．２活力变化。最后证明，三种细菌生物被膜形成能力、生物被膜中活菌数目以及ＡＩ－２活力顺序均是金黄色葡　萄球菌＞大肠杆菌＞沙门氏菌。添加呋喃酮之后，三种细菌的生物被膜形成能力以及ＡＩ．２活力均下降，其中金黄色葡萄球菌的生物被　膜形成能力下降为原来的２５％。因此表明，此三种细菌生物被膜形成能力的大小可能是是通过调节生物被膜中ＡＩ一２的活力实现的。　关键词：金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；沙门氏菌；细菌生物被膜　文章篇号：１６７３．９０７８（２０１４）１．８７．９０　Ｂｉｏｆｉｌｍ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｓｐｏｉｌｉｎｇ　Ｍｉｌｋ　ＺＨＯＵ　Ｗｅｎ－ｙｕａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ，Ｊ１＿ＡＮＧ　ｙａｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｈｕｉ－ｃｈａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｓｈｅｎｇ－ｈｕａ，ＬＩＡＯ　Ｄｉｎｇ－ｍｅｉ，　ＧＵＯ　Ｋａｉ，ＺＪ　Ｇ　Ｗｅｎ－ｙｕａｎ．ＹＡＮＧ　Ａｎ－ｌｉｎ．　（Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｌｉｇｈｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ　ｔｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０００６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｂｒｏｕｇｈｔ　ｇｒｅａｔ　ｔｈｒｅａｔ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｕｓ　ｉｔ　ｉｓ　ｖｅｒｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｏ　ｒ℃ｓｅａｒ＿ｃｈ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏｆｉｌｍｄｕｒｉｎｇｍｉｋｃｏｒｒｕｐｔｉｌｏｎａｎｄｆｉｎｄ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｗａｙｔｏ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅｖｉａｂｌｅ　ｃｏｕｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＡＩ－２　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕＦｅｌＺ￣，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｍｉｌｋ　ｓｐｏｉｌａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｎｖｅｓｔｉｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆｂｉｏｆｉｌｍ　ａｎｄ　ＡＩ一２　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆｆｕｒａｎｏｎｅ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆｆｕｒａｎｏｎｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｕｒａｎｏｎｅ　ａｎｄｔｈｅｑｕａｎｔｉｙｏｆｂａｔｔｅｒｉａｉｎｔｈｅ　ｂｉｏｆｉｌｍ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈａｔｔｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｒｅｅｂａｃｔｅｒｉａｆｏｒｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｙ，ｔｔｈｅｖｉａｂｌｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍａｎｄｔｈｅＡＩ－２　ａｃｔｉｖｉｙｗａｓＳｔｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ　＞Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ＞Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｔｈｅ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｙ　ａｔｎｄ　ＡＩ－２　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｏｔｈ　ｄｅｃｌｎｅｄ　ａｆｔｉｅｒ　ａｄｄｉｎｇ　ｆｕｒａｎｏｎｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｒｅｄｕｃｅｄｔｏ　２５％．Ｔｈｕｓｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ　ａｂｉｌｉｙｏｆｂｉｔｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｉｈｔｂｅｇ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙ　ｈｅＡＩ－２　ｔａｃｔｉｖｉｙｗｈｉｃｈｗａｓ　ｔｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｔｈｅｖｉａｂｌｅｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；Ｓａｌｍｏｅｌｌａ；ｂｉｏｆｉｌｍ　生物被膜是微生物为适应胁迫环境、形成有利于　生存的特殊生长状态。是由自身分泌胞外粘质物（如　多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等）包裹的，具有高　度组织化的多细胞群体结构【ｌ　。生物被膜的形成机制　非常复杂，近来研究表明其形成与群体感应系统的调　控密切相关。１９９３年，在哈氏弧菌中发现信号分子　（Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ－２，ＡＩ一２），其化学结构是呋喃酮酰硼酸二　酯【３Ｊ，其属于种间传递信号分子。目前发现该信号分　收稿日期：２０１３＿０　２３　基金项目：国家自然科学基金（３１３０１４８０）；广东省２１１重点学科广东工业大　学轻工化工学院创新人才项目；广东省大学生创新实验项目（２０１００４４）　子及其合成酶ＬｕｘＳ保守且存在于超过６０种微生物　中，大量研究已经证明ＡＩ一２不仅在细菌与细菌之间，　甚至在细菌与真菌之间的通讯也起到非常重要作用　。在Ｓｔａｎｋｏｗｓｋａ的研究中已经报道了　．２与生物被　膜形成的关系，探讨了群体感应抑制分子在其生物被　膜的形成中具有重要的作用［５】。由于生物被膜的形成　在卫生医疗以及食品安全等领域具有严重威胁，因此　前人做了大量的研究来抑制生物被膜形成，如利用抗　菌肽、香精油类等抑制生物被膜的研究　。近年来，　越来越多的科学家将目光投注到群体感应抑制分子呋　喃酮上，证实呋喃酮可以作为合成　．２中前提物质　ＤＰＤ（４，５．ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－２，３－ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｎｅ）的结构类似物，　抑制群体感应信号分子ＡＩ．２的合成，在控制相关食源　菌生物被膜形成方面，具有重要的作用【８】。　牛奶是日常食品消费中最容易发生的食品之　８７　作者简介：周文渊（１　９９０年一），男，硕士研究生，研究方向为食源微生物耐药　机制　通讯作者：张宏梅（１　９７５年一），女，博士，副教授，研究方向为食源微生物耐　药机翱Ｊ　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．１　一，其现象随处可见。控制牛奶的难点之一　是控制菌体生物被膜形成。很多学者在探索牛奶中生　物被膜形成时，分离鉴定出金黄色葡萄球菌，肠炎沙　门氏菌以及大肠杆菌是牛奶生物被膜中主要细　菌，在实验室条件下对其进行逐一研究　Ｊ。然而牛奶　过程中各组分变化复杂，可能都会对菌体生物被　膜形成能力造成影响。因此探讨牛奶中多种食源　性细菌生物被膜特性对于生物被膜研究而言，是十分　必要的。呋喃酮类物质广泛存在于草莓、葡萄、橙橘、　芒果等多种天然水果中，是一种食品中常见的安全香　精成分之～。因此，本实验选用牛奶中常见的食　源性病原菌（金黄色葡萄球菌，肠炎沙门氏菌以及大肠　杆菌）为研究对象，通过模拟牛奶过程，测定牛奶　中不同细菌生物被膜形成特征以及种问信号分子　ＡＩ一２活力变化，然后探讨牛奶中加入呋喃酮对ＡＩ．２　活力和生物被膜形成能力的影响，为在食品加工过程　中预防牛奶、控制生物成膜形成奠定研究基础。　１材料和方法　１．１　材料　金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３，肠炎沙门氏菌　ＡＴＣＣｌ４０２８和大肠杆菌ＡＴＣＣ８７３９为作者实验室ＴＳＢ　培养基（胰蛋白胨大豆肉汤培养基）一８０℃下冻存；　哈氏弧菌ＢＢ１７０购自美国典型菌种保藏中心　（ＡＴＣＣ），于ＡＢ培养基【１０］中培育孵化；胰蛋白胨大　豆肉汤培养基（ＴＳＢ培养基）、Ｈｅｋｔｏｅｎ　Ｅｎｔｅｒｉｃ琼脂　培养基、Ｂａｉｒｄ－Ｐａｒｋｅｒ琼脂基础培养基以及伊红美蓝琼　脂培养基购自中国青岛海博微生物科技有限公司；呋　喃酮（４．羟基一２，５．二甲基．３（２Ｈ）呋喃酮）（纯度　９％）　购自阿拉丁试剂（中国上海）有限公司；牛奶（中国　伊利）购自中国广州大学城世博超市。　１．２　方法　１．２．１生物成膜形成能力（Ｂ值）测定　参考文献【ｌｌＪ并稍作改进，将过夜培养的三种细　菌金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３，肠炎沙门氏菌　ＡＴＣＣｌ４０２８和大肠杆菌ＡＴＣＣ８７３９活化，３７℃下培养　２０　ｈ后，配成ＯＤ６００值为０．１（约为１．５ｘ１０　ｃｆｕ／ｍＬ），然　后按ｌ：１００接种于事先装有１００　牛奶培养基的标准　９６孔板中。分别在３０℃过夜培养４８　ｈ后，用酶标仪（美　国，Ｂｉｏ．ｒａｄ）测定波长６３０　ａｍ处的光密度值Ａ１，未接　菌空白培养基的为Ａ　ｃ，测试后，倒掉培养基，用蒸馏　水洗涤３次去除浮游菌，微孔板在室温下干燥２　ｈ，加　入１０　ｇ，Ｌ结晶紫１００　Ｌ／孔，放置２０　ｍｉｎ后，蒸馏水水　８８　洗　７次去除孔壁染液直至水洗液为无色，孔板在室　温下干燥３０　ｍｉｎ，加入９５％乙醇１００　ｕＬ／孔，微量震荡　器上震荡３０　ｍｉｎ后，用酶标仪测定Ａ２、Ａ２ｃ。实验平行　三次。粘附率Ｂ值计算为　：　二　￡　４—４　１．２．２生物被膜中活菌教检测　取三种细菌菌悬液（约为１．５×１０　ｃｆｕ／ｍＬ）１０　ｕＬ　接种于含牛奶１　ｍＬ的２４孔板中，同时放入不锈钢片　（０．５　ｃｒｕｘ０．５　ｃｍ），然后在３０℃下分别培养４８　ｈ，　取出不锈钢片，放入盛有５　ｍＬ灭菌的ＰＢＳ的无　菌溶液中进行冲洗，轻轻翻转５次，弃去ＰＢＳ，　重复冲洗３次后取出，用无菌纱布吸干多余的液　体，洗掉浮游菌。用消过毒的棉棒轻轻擦刮，然　后将其与擦刮棒一起放入盛有４　ｍＬ灭菌的ＰＢＳ　的试管中，将试管放在试管架上，浸没在超声水　浴中震荡１０　ｍｉｎ（４２～４７　Ｈｚ、２０℃）后，再漩涡　震荡２　ｍｉｎ。每个试管溶液在ＰＢＳ中做系列ｌ０倍　稀释，选择适宜稀释度，分别取１　ｍＬ稀释液加入　无菌培养皿中，并分别倾注冷却至４５℃的Ｈｅｋｔｏｅｎ　Ｅｎｔｅｒｉｃ琼脂培养基、Ｂａｉｒｄ　Ｐａｒｋｅｒ琼脂基础培养基以　及伊红美蓝琼脂培养基２０　ｍＬ，３７℃培养４８　ｈ，观　察菌落生长情况，作细菌计数。　１．２．３　细菌ＡＩ．２活力研究　本方法参考文献Ｌ１２＿Ｊ并加以改进，将已经活化的　ＡＩ一２报告菌株Ｖ．ＢＢ１７０挑至３　ｍＬ　ＡＢ培养液中，于　３Ｏ℃摇床转速２００　ｒ／ｍｉｎ培养１６　ｈ至ＯＤ６０ｏ为０．９左　右。用新鲜的ＡＢ培养基以１：５０００稀释Ｖ．ＢＢ１７０培养　物。同时，将三种测试菌株分别在牛奶以及溶解１０　ｇｍｏｌ／ｍＬ呋喃酮的牛奶条件下，经过３７℃培养４８　ｈ　后，接着在１３０００　ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ后取上清，该上　清液用０．２２　ｇｍ滤膜进行过滤后，同时将培养好的报　告菌哈氏弧菌Ｖ．ＢＢ１７０无细胞上清液作为阳性对照。　将各种细菌的无细胞上清ｌＯ　与稀释过的Ｖ．ＢＢ１７０　培养物１００　混合，加入９６孔板中，于３０℃下震荡　孵育，用多功能酶标仪Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００（瑞士，Ｔｅｃａｎ公司）　每隔１　ｈ测一次发光值，直至５　ｈ，选出较稳定的发光　值，实验样品平行三份，重复三次。　１．２．４呋喃酮对细菌生物被膜形成能力的影响　参考文献［１３１并加以改进，首先将呋喃酮用灭　菌后双蒸水稀释成６０和６００　ｇｍｏｌ／Ｌ，然后再进一　步稀释成１．０、２．０、４．０、８．０、１６．０、３２．０　ｇｍｏｌ／Ｌ后取　１００　ｇＬ加入９６孔板中。取相同体积的灭菌后双蒸水　作为阴性对照，接种各种细菌后培养４８　ｈ。按方法１．２．１　和１．２．３测定其ＡＩ－２活力以及生物被膜形成能力。　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．１　１．３数据统计　统计学分析全部数据采用ＳＰＳＳ　１　７．０统计软件处　理，通过Ｇｒｕｂｂｓ检验法取舍适当数据。　２结果与分析　２．１　生物成膜能力（Ｂ值）及其活菌数目测定　牛奶中接种多种常见食源性细菌（金黄色葡萄球　菌、沙门氏菌和大肠杆菌），随后在３Ｏ℃下培养后观　察其过程，最后利用微孔板法测定其生物成膜能　力以及生物膜中活菌数目见表１。　表１各种在牛奶中成膜能力及其活菌计数情况　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｂｉｏｆｉｆｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｃｏｕｎｔ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｌｋ　菌株　Ｂ值　Ｂ值（呋喃酮）活菌￣ｋ／（１ｇｃｆｕ／ｍＬ）　１　１　Ｏ　Ｏ　４　２　Ｏ　８　６　如表ｌ所示，三种细菌中金黄色葡萄球菌的成膜　能力最大，其粘附率（Ｂ值）分别是大肠杆菌和沙门　氏菌的１０倍和ｌ６倍，这说明三种细菌中金黄色葡萄　球菌在牛奶中最容易形成生物被膜。随后，在牛奶中　添加一定浓度的呋喃酮之后，发现三种细菌的生物被　膜形成能力均有所下降，其中金黄色葡萄球菌的生物　被膜形成能力下降最大，变成原来的２５％。通过菌落　计数法计算生物膜中活菌数目结果表明，三种细菌中　金黄色葡萄球菌在生物被膜中的活菌数目最大，沙门　氏菌的活菌数目最小。通过几种食源性细菌在牛奶中　生物成膜能力以及活菌数目测定结果可以看出，在生　物膜中具有较大活菌数目的菌株，其粘附率也较大。　同时，呋喃酮作为ＡＪ．２的抑制剂，可以有效抑制三种　细菌生物被膜形成。　２．２　细菌ＡＩ一２活力研究　通过报告菌株Ｖ．ＢＢ１７０的生物发光，我们测定菌　株的ＡＩ．２活力。将沙门氏菌ＡＴＣＣ１４０２８的ＡＪ．２活力　作为基数１，计算三种细菌分别在牛奶以及牛奶与呋　喃酮混合物中培养后ＡＩ．２活力引起Ｖ．ＢＢ１７０发光相　对值，结果如图ｌ所示。　从图ｌ中可以看到，沙门氏菌的ＡＩ一２活力相对值　最小，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌ＡＩ．２活力分别是沙　门氏菌的１．２６和１．２４倍。通过研究三种细菌ＡＩ．２活　力，我们发现三者的ＡＩ．２活力大小顺序是金黄色葡萄　球菌＞大肠杆菌＞沙门氏菌，此顺序与生物被膜形成能　力大小顺序以及活菌数目大小顺序一致。而且加入呋　喃酮后，三种细菌的ＡＩ．２活力均有所下降。并且，下　降之后其生物被膜形成能力以及ＡＩ一２活力依旧呈现　一致变化。在本实验的三种细菌中，大肠杆菌的生物　被膜形成能力以及ＡＩ一２活力受呋喃酮抑制效果最明　显。因此，笔者认为三种细菌的生物被膜形成能力均　通过生物被膜中活菌分泌的ＡＩ一２活力控制。　霞　蜒　Ｏ　Ｏ　Ｏ　４　２　Ｏ　沙门氏菌　金黄色葡萄球菌　大肠杆菌　菌株　图１不同细菌Ａｌ＿２活力相对值　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＡＩ・２　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　２．３　呋喃酮抑制细菌生物形成能力　呋哺酮浓度／（￣ｎｏｌ／Ｌ）　图２不同浓度呋喃酮下沙门氏菌ＡＴＣＣ１　４０２８浓度　Ｆｉｇ．２ＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏａｓ　ｏｆ　ｆｕｒａｎｏｎｅ　基于呋喃酮是菌体ＡＩ一２合成中的的４，５一羟基一２，３一　戊二酮（ＤＰＤ）的结构类似物，可能抑制ＡＩ．２的生物　合成。于是我们通过在牛奶中添加不同浓度的呋喃酮，　检测了ＡＩ．２在三种食源性细菌生物被膜形成过程中　的作用。如图２、３、４所示，图中Ａ１－Ａｌｃ表示微孔　板中总菌数的ＯＤ６３０值，Ａ２．Ａ２ｃ表示微孔板中生物被　膜中细菌的的Ｏ１９６３ｏ值。结果表明呋喃酮并不影响沙　门氏菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌总菌数的变化，　但是，随着加入呋喃酮浓度的增加，沙门氏菌、金黄　色葡萄球菌以及大肠杆菌生物被膜内细菌浓度会不断　８９　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．１　递减，其中大肠杆菌受呋喃酮影响最大。当加入３２　￣ｍｏｌ／Ｌ的呋喃酮时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及　沙门氏菌生物被膜中细菌浓度分别为不加入呋喃酮时　的０，５３、０．５９以及０．２５倍。我们加入不同浓度的呋喃　酮，观察到呋喃酮会通过抑制生物膜中细菌的浓度　（Ａ２一Ａ２ｃ），抑制生物成膜能力，而且，此过程中，　总菌数基本不会改变。关于呋喃酮抑制生物被膜中细　菌而对总菌数（Ａ１．Ａｌｅ）生长无影响的结果与Ｌ．Ｋ　Ｖｅｓｔｂｙ等人的研究一致Ｌｌ圳。　０　《　ｔ－３　呋喃酮浓度／（ｒｔｒｎｏ￣Ｌ）　图３不同浓度呋喃酮下金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３浓度　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ￣ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｆｕｒａｎｏｎｅ　０　《　怎　恶　呋喃酮浓度／（￣ｍｏｌ／Ｌ）　图４不同浓度呋喃酮下大肠杆菌ＡＴＣＣ８７３９浓度　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆＥ．ｃｏｌｉ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｆｕｒａｎｏｎｅ　３结论　采用微孔板法模拟牛奶条件，测定金黄色葡　萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌在牛奶过程中的生　物被膜形成能力、生物被膜中活菌数目。发现在生物　膜中具有较大活菌数目的菌株，其粘附率也较大。随　后在加入ＡＩ一２抑制剂呋喃酮后，观察到三种细菌的Ｂ　值以及ＡＪ一２活力均有所下降。并且，下降之后其生物　被膜形成能力以及ＡＩ一２活力依旧呈现一致变化。因此　证明细菌生物被膜形成能力通过生物被膜中活菌分泌　ＡＩ．２。最后通过加入梯度浓度呋喃酮，检测到呋　喃酮可以抑制生物被膜中细菌数目，但对于总菌数变　化并无影响。　参考文献　［１］　Ｂｍｇｎｏｎｉ　ＬＩ，Ｌｏｚａｎｏ　ＪＥ，Ｃｕｂｉｔｔｏ　ＭＡ．Ｅｆｉｆｃａｃｙ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｐｏｃｈｌｏｆｉｔｅ　ａｎｄ　ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ　ａｍｍｏｎｉｍｕ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｏｎ　ｙｅａｓｔｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｒｆｏｍ　ａｐｐｌｅ　ｊｕｉｃｅ［Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，３５：１０４－ｌ１９　［２］Ｂｕｆｆｅｔ－Ｂａｔａｉｌｌｏｎ　Ｓ，Ｂｒａｎｇｅｒ　Ｂ，Ｃｏｒｍｉｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｑｕａｔｅｍａｒｙ　ａｍｍｏｎｉｍｕ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ｃｌｎｉｉｃａｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｎ　ｎａｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｏｕｔｃｏｍｅｓ［Ｊ】．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｈｏｓｐｉｔａｌ　ｎｉｆｅｃｔｉｏｎ，２０１　１，７９：１４１－１４６　［３］　Ｂａｓｓｌｅｒ　Ｂ　Ｌ，ｗｒｉｈｇｔ　Ｍ，Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ　ＲＥ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌｌｎｉｇ　ｉｎ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｍｕｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ【Ｊ］．　１９９３．９：７７３—７８６　［４］　Ａｈｍｅｄ　ＮＡ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　ＦＣ，Ｓｃｈｅｉｅ　ＡＡ．ＡＩ一２　ｑｕｏｒｕｍ　ｓｅｎｓｎｉｇ　ａｆｆｅｃｔｓ　ｎａｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｎｉ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎａｇｉｎｏｓｕｓ［Ｊ］．　Ｊ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００７，６０：４９—５３　【５】　Ｓｔａｎｋｏｗｓｋａ　Ｄ，Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ　Ｇ　Ｒｏｚａｌｓｋａ　Ｓ，ｅｔ　１ａ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｑｕｏｒｕｍ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ｓｉｎｇａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｏｎ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　０１８［Ｊ］．Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，２０１２，５７：　５３—６Ｏ　［６】　Ｋｗｉｃｅｉｎｓｋｉ　Ｊ，Ｅｉｃｋ　Ｓ，Ｗｏｊｃｉｋ　Ｋ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｅａ　ｔｒｅｅ　（Ｍｅｌｌａｅｕｃａ　ａｌｔｅｍｉｆｏｌｉａ）ｏｉｌ　ｏｎ　Ｓｔａｐｈｙ　ｌｃｏｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｉｎ　ｂｉｏｆｉｌｍｓ　ｎａｄ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ［Ｊ】．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｇｅｎｔｓ，２００９，３３：３４３・３４７　【７】　Ｓｃｈｌａｆｅｒ　Ｓ，Ｒａａｒｕｐ　ＭＫ，ＷｅｊｓｅＰＬ，ｅｔａ１．Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｄｅｎｔａｌ　ｂｉｏｆｉｌｍ　［Ｊ］．ＰｌｏＳ　ｏｎｅ，２０１２，７：ｅ４１５３４　［８］　Ｊｎａｇ　ＹＪ，Ｃｈｏｉ　ＹＪ，Ｌｅｅ　ＳＨ，ｅｔ　ａ１．Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ　２　ｏｆ　Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｒｎ　ａｓ　ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　ｏｒａｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，５８：１７—２７　［９】　Ｑｕｉｇｌｅｙ　Ｌ，Ｏ＇Ｓｕｌｌｉｖａｎ　０，Ｓｔａｎｔｏｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｏｆ　ｒａｗ　ｍｉｌｋ【Ｊ】．ＦＥＭＳ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｒｅｖｉｅｗｓ，　２０１３，３７：６６４－６９８　【１０】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　Ｅ，Ｈａｓｔｎｉｇｓ　Ｊ，Ｕｌｉｔｚｕｒ　Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｂｅｎｅｃｋｅａ　ｈａｒｖｅｙｉ　ｂｙ　ｏｔｈｅｒ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ】．　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９７９，１２０：８７－９１　（下转第９５页）　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．１　（上接第９Ｏ页）　［１１】Ｒｏｄｅ　ＴＭ，Ｌａｎｇｓｒｕｄ　Ｓ，ＨｏｌｃｋＡ，ｅｔａ１．ＤｉｆｅｒｅｎｔｐａＲｅｍｓ　ｏｆ　ｂｉｏｆｉｍ　ｆｌｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｕｎｄｅｒ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ－２　Ｐｒｄｕｃｏｉｔｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｃｏｌｏｓ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１Ｃ．１．１－１Ｃ．１．１５　ｆｏｏｄ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｆｏｏｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１　１６：３７２－３８３　［１３］Ｖｅｓｔｂｙ　ＬＫ，Ｌｏｎｎ－Ｓｔｅｎｓｒｕｄ　Ｊ，Ｍｏｒｅｔｒｏ　Ｌ　ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｆｕｒａｎｏｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓ　ｏｎ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　［１２】Ｔａｇａ　ＭＥ，Ｘａｖｉｅｒ　ＫＢ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｌａ　ｎ　ｉｂｉｏｆｉｍ［ｌＪ］．Ｊ．Ａｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，２０１０，１０８：７７１—７７８