阴道毛滴虫长期培养传代的实验观察

１６　文章编号：１６７３—７５８Ｘ（２００９）０１—００１６—０３　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｒｅｖ　Ｍｅｄ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００９。Ｖ０ｌ　１５　Ｎｏ．１　中图分类号：Ｒ３８２．２　１　文献标识码：Ａ　阴道毛滴虫长期培养传代的实验观察　刘晓泉　，田春林　，王卫群　，廖志红　１广西医科大学人体寄生虫学教研室（南宁５３００２１）２广西医科大学生物化学与分子生物学教研室（南宁５３００２１）　【摘要】　目的观察阴道毛滴虫长期传代培养的适宜条件，为教学、科研提供实验虫株。　方法制备肝浸液培养　基，改良培养方法，接种培养后，观察虫的密度与培养时间、培养基体积、培养温度以及灭活血清和未灭活血清对虫株发　育繁殖的影响。结果本实验成功培养传代达３年以上，前期培养１年内，虫株适应新的生长环境。后期为培养１年后，　虫株培养达到稳定，优化培养条件，培养保存时间达到１６天。结论长期传代培养阴道毛滴虫，适当降低培养温度、减　少培养基内虫体的密度、增加培养基体积能有效的延长体外培养时间。　【关键词】阴道毛滴虫；肝浸液培养基；培养　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　ｕＵ　Ｘｉｏｘ￣ｃｌｕａｎ，ＴＩＡＮ　Ｃｈｕｎ－ｌｉｎ，　ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ－ｑｕｎ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３００２１，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＷＯＩ１ＴＩ　ｓｔｒａｉｎ　ｆｏｒ　ｔｅａｃｈｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ，ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅｎｌｌＴｌ　ａｎｄ　ｕｎ—ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅｌＭｔｎ　ｏｎ　Ｔｒｉ—　ｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｅｒｉａｌ　ｐａｓｓａｇｅ　ｆｏｒ　Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　Ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｆｏｒ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｔｈｒｅｅ　ｙｅａｒｓ．Ｗｈｅｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｗｉｔｈｉｎ　ｏｎｅ　ｙｅａｒ，ｔｈｅ　ＷＯｎＴＩ　ｓｔａｒｔｅｄ　ｔｏ　ａｄａｐｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｗａｓ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｏｎｅ　ｙｅａｒ．Ａｆｔｅｒ　ｇｉｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｃｏｎｄｉ—　ｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｔｉｍｅ　Ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　１６　ｄａｙｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｐａｓｓｇｅ　ｃｕｌａｔｕｒｉｎｇ　ｉｓ　ｎｅｅｄｅｄ，ｄｅ－　ｃｒｅａｓｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｌｙ，ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｗｏｒｍ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｍ　ａｕｎｄ　ｒａｉｓｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｖｏｌｕｍｅ　ｃａｎ　ｅｘｔｅｎｄ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ：ｌａｖｅｒ　ｉｆｕｓｎｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ；Ｃｕｌｔｕｒｅ　阴道毛滴虫（Ｔｒｉｅｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ　Ｄｏｎｎｅ，１８３７），　检，确诊后，取其分泌物置于无菌器皿，迅速带回实　验室分离培养。　由Ｄｏｎｎｅ于１８３６年首先在女性阴道分泌物中发　现。本虫主要寄居于女性阴道和泌尿道，引起滴虫　性阴道炎和泌尿道炎症，也可感染男性泌尿道系统，　造成炎症病变“】。体外培养阴道毛滴虫在教学、科研　１．２培养基的制备采用陈佩惠等乜　所著方法：取　牛或兔的肝脏１５ｇ，切或剪碎成小米粒大小浸入　１００ｍｌ蒸馏水中，置冰箱中过夜。次日煮沸半小时，　经多层纱布过滤去渣滓，失去的水分以蒸馏水补足　中是一项重要的基础工作，特别是近年来分子克隆　技术的发展，使阴道毛滴虫科学研究开拓了新的领　到１００ｍｌ，即成１５％的肝浸液。按每１００ｍｌ肝浸液加　２ｇ蛋白胨和０．５ｇ葡萄糖水浴混匀，每试管５ｍ１分　装，按８磅（１１３℃）高压２０分钟，冷却后置３７℃恒温　箱中２４ｈ，证明无菌后贮存４￣Ｃ箱中备用。　为了进行无菌培养，在培养基中加入青、链霉　域，需要分离培养出高质量虫体。本实验是在经过３　年以上对阴道毛滴虫的无菌培养且中间无需经过液　氮保种的情况下，对虫株进行培养基条件变化的观　察。　１材料与方法　素。各加１０ｍｌ双蒸水，溶解青、链霉素各２０万单位，　每毫升培养液加入稀释后的抗生素液各０．０５～　１．１虫株来自广西医科大学第一附属医院白带　常规检查发现的带虫患者。用消毒棉签拭子在阴道　后穹隆处或阴道壁上取分泌物做生理盐水涂片镜　作者简介：刘晓泉（１９７５一），男，广西平乐县人，助理实验师，主要从事　人体寄生虫学实验工作教学。　０．０７５ｍｌ，即为每毫升培养液含１　０００～１　５００单位。　１．３培养与接种接种前每管加灭活无菌牛血清　ｌｍｌ和按每毫升培养基中加青、链霉素各１　０００～１　５００　单位。在无菌操作下，将含阴道毛滴虫的分泌物接　种到培养基中。在３７℃隔水式培养箱培养。　应用预防医学２００９年２月第ｌ５卷第１期　１７　由于从体内转到体外培养，虫株在培养基中有　一稳定。第６天ａ组虫体基本死亡，ｂ组仍有活的虫　体，且多聚于上层。通过几次分组培养，实验结果相　同，ｂ组最长可存活８天。　２．２．２取培养３天的２．２．１中所述的ｂ组各１／　３ｍｌ，分别接种在含培养基５ｍｌ、７ｍｌ、ｌＯｍｌ的试管中，　个适应环境的过程。在开始时滴虫数量４８小时达　到高峰，每１～２天转种１次，１个月后可３～４天转　种１次，持续１年时间。每次转种时吸取培养基下层　和底部ｂ　液体接种，并观察培养基各部的虫体数量、　存活率及活力观察。后期，即初期培养１年后，吸取　上层的培养基液转种，分别进行培养基中阴道毛滴　不同量的培养基也分别接种３管，在３７ｏ【＝培养２天　后进行每天观察。５ｍｌ组培养至第８天基本死亡，７ｍｌ　组可达１０　１１天，ｌＯｍｌ组也基本在１３天左右。　２．２．３将２．２．２中的ｌＯｍｌ培养组分别在室温２６￣Ｃ、　虫的分布、大小、运动繁殖情况、转种虫数量和培养　时间、培养温度、增加培养基的体积、是否进行小牛　血清灭活等观察。　２结果　２．Ｉ培养前期、后期阴道毛滴虫的生长　２．１．１前期培养转种持续１年左右时间，观察培　养基中阴道毛滴虫分布情况、活虫率和正常虫数，结　果与文献报道相符ｂ］。转种培养１年阶段，培养基分　布为４层，即上层、絮状层、下层和底部，活虫率、正　常虫数及虫体活力为下层＞上层＞底部＞絮状层，　下层虫体大小均一，多见二繁殖虫体，上层虫体　大小与下层基本相同，但少见二繁殖的虫体，底　部虫体大小不一，有二繁殖虫体；这个阶段中培　养的阴道毛滴虫在培养基中的运动以圆形的旋转式　运动为主，也有少量以扁椭圆形运动。在１年期培养　的后期，上层的虫体活虫率、正常虫数及活力明显大　于其它层，絮状层和下层虫体分布减少。　２．Ｉ．２后期培养吸取上层的培养基进行转种，上　层的活虫率、正常虫数及活力更加明显，而絮状层、　下层则几乎消失，仅有上层、底部以及底部沉淀和培　养基液体之间约３～４ｍｍ高度的混浊层。活虫率、正　常虫数及活力高的上层虫子大小均一，上层的下部　和混浊层多见二繁殖的虫体，底部也能见到二　繁殖的虫体和较多的衰老虫体；上层虫子活动　能力强，弧形向前运动为主。　２．２培养转种虫数量、培养基体积、培养时间以及　培养温度的观察　２．２．１后期培养虫体为转种来源，培养时分２组进　行培养，一组（ａ组）吸取约ｌｍｌ培养基中上层液的　阴道毛滴虫进行转种（用血球计数板计数虫体密度　５　０００～１０　０００个／ｍ１），另一组（ｂ组）取１／３ｍｌ，每组　分别接种３管。３７℃培养第３天、第４天培养基中的　分层逐步分为上层、混浊层和底部。两组分别培养　的虫体密度在第３、４天各层都是ａ组＞ｂ组。至第５　天后各层数量基本相等，ａ组底部死虫数明显多于ｂ　组。至第５天，ａ组中虫体数量明显减少，ｂ组仍趋于　３０℃、３３．５ｃｃ、３７￣Ｃ分４组进行培养，每组接种３管，　培养第２天后进行每天观察。观察结果见表１。　表１　阴道毛滴虫培养温度、培养时间和虫体活力的关系　２．３培养前期、后期分别用灭活与不灭活新生小牛　血清进行转种　前期：灭活血清与未灭活血清分别接种３管，　每管各接种ｌｍｌ含阴道毛滴虫培养３天的培养液，　２天后用血球计数板计数冲匀培养基的虫体密度，　计数３次取平均值。灭活血清组生长正常，死虫和　活虫都很多，活虫平均密度６　７８２个／ｍｌ，死虫平均　密度１　２４６个／ｍｌ；未灭活血清组虫体基本上不进行　繁殖，死亡虫体多是原先接种的活虫，活虫平均　密度１３７个／ｍｌ，死虫平均密度２１６个／ｍｌ。　后期：经过长时间灭活血清培养后，再进行灭　活血清与未灭活血清对照培养，分别接３管，２天　后进行计数，方法同前期。灭活血清组平均活虫密　度７　０３５个／ｒｎｌ，死虫密度１　４８９个／ｍｌ；未灭活血清　组平均活虫密度６　９８３个／ｍｌ，死虫密度１　３４３个／　ｒｎｌ。经ｔ检验，Ｐ＞０．０５，后期培养用灭活与不灭活血　清的活虫数量无明显区别。　３讨论　阴道毛滴虫的培养方法，特别是肝浸液的体外　培养方法已得到广泛运用，已有文献报道，但如此长　时间的培养传代后，比较虫体培养前期与后期的生　长状况，并择优化的虫株进行影响阴道毛滴虫生长　相关因素培养比较观察，还未见报道。本文观察结　果显示，培养初期培养基中虫体的分布与文献报道　相似ｂ】，但培养１年后虫体培养基中的分布已经有　１８　Ａｐｏｌｉｅｄ　Ｐｒｅｙ　Ｍｅｄ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００９．Ｖｏｌｌ５　Ｎｏ．１　明显的改变，仅有上层、混浊层和底部，正常虫体明　显聚集于上层，可能是所用培养基不同ｂ】，也可能是　由于虫体经过较长时间的体外液体培养基中培养，　推想有可能是阴道毛滴虫刚从一个生长环境到另一　个生长环境中，相对的抵抗力下降，受到血清中未灭　活抗体、补体等的影响，所以前期培养灭活血清的培　养基虫数多于未灭活血清培养基虫数；后期再进行　对照实验，由于长时间的转种传代，使阴道毛滴虫适　应能力、抵抗力增强，再进行灭活与未灭活血清培养　对照，虫体数量无明显区别，后期培养新购的血清可　以不用灭活。　培养基底层沉降了较多的死亡虫体以及死亡虫体的　裂解产生的某种物质不利于活虫生长，使培养基中　的有活力阴道毛滴虫本能的向上层移动，这个过程　中虫体的运动方式由圆形的旋转式运动向弧形向前　运动改变。培养中增大培养基体积，不仅虫的养料　增加，而且对代谢产物、死虫的裂解产物等有稀释作　用，有利于生长环境在一定时间内平衡稳定。在转　种虫的数量不同，其它条件相同的情况下，在一定的　时问培养后培养基上层的虫数近于相等，底部死虫　数以转种虫数量多者为多，说明培养基的体积对应　所能够容纳到一个最多的虫数，也就是一个最大的　经过长时问的传代，再次培养时减少转种虫数　量，增加培养基体积，在温度３３．５℃时，能够较好的　延长体外培养的生长时间，减少了培养次数，并能够　在１次培养下保证１周的实验教学活体观察。另外　培养基中上层的虫体活跃、活力强、数量多，大小基　本相等，从培养基中吸出上层的液体，经过２～３次　反复离心洗涤后，得到了纯度高、活虫率高的高质量　虫体，为阴道毛滴虫教学标本的制作和科学研究提　供实验室虫株。　【参考文献】　虫密度，达到这个密度后将维持一段时间平衡，当培　养基的养料不能满足这个平衡中的虫体所需时，这　个平衡就会被打破，虫体将减少，最后全部死亡。众　所周知，温度高时生物的新陈代谢将会加快，消耗的　能量就越多，阴道毛滴虫也不例外，从阴道毛滴虫体　外培养实验中看出，当温度处于３３．５℃和３７℃时，　阴道毛滴虫的活力、繁殖状况处于极佳状态，但由于　【１】吴观陵．人体寄生虫学【Ｍ】．第３版．北京：人民卫生　出版社，２００５．１１２．　【２１陈佩惠，孔德芳，李慧珠，等．人体寄生虫学实验技术　［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８８．４４—４５．　３７℃温度高，新陈代谢更快，繁殖速度加快，培　养基中养料就消耗多，自然３５￣Ｃ温度下的培养时间　就比３７℃的要长　Ｉ。温度低如２６ｃ【二和３０℃，达不到　［３】李新社．阴道毛滴虫在无菌培养基中的分布情况…．　中国寄生虫学与寄生虫病杂志，１９９０，８（２）：１４．　［４］刘芸，吴少慧，刘敏，等．阴道毛滴虫保存方法及时　间的效果观察［Ｊ］．中国公共卫生，２００６，２２（１）：４９　收稿日期：２００８—１０—２１　阴道毛滴虫合适的繁殖生长温度，繁殖传代受到影　响，不适合培养传代。培养前期和后期，分别进行灭　活和不灭活新生牛血清培养对照实验，从实验结果　网上投稿注意事项　本刊接受网上投稿，邮箱ＧＸＹＸ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｍａ１．ｎｅｔ．ｃｎ，但需注意下列事项：　（１）作者网上投稿后，请务必通过邮局将单位推荐信（盖上公章）及审稿费３Ｏ元寄至本刊编辑部。　（２）网上投稿后可在投稿邮箱中查到本刊回复，半个月内可收到本刊发出的收稿回执（注明稿件编号）。　（３）网上投稿的稿件请以ｗｏｒｄ编辑，务必以附件的形式发出，注意文档不要设密码。网上新投稿，请在文　章题目左上角注明“投稿”字样，如为邮寄投稿后补充电子文本并请注明“补电子文本”及论文编号，退回的修　改稿件请注明“修改稿”及论文编号。　（４）网上投稿时请注意标明第一作者单位、地址、邮编、电话、传真和电子邮箱，以便本刊与您联系。　（５）作者请勿利用电子邮件的便捷一稿两投。　本刊编辑部