菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定
１5食安(1)班 张凯
摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法与透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度得菠萝皮经两种不同得纯化方法处理,菠萝皮中得蛋白酶都能被有效纯化,但就是蛋白酶活性会损失一部分、
关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性;
前 言
菠萝蛋白酶(bromelａｉｎ)就是从菠萝植株中提取得一类蛋白水解酶得总称,主要存在于菠萝茎与果实中,根据提取部位得不同,分为茎菠萝蛋白酶与果菠萝蛋白酶。Mａrcaｎo于18９1年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶、随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药与化工领域有很好得利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶得一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域、随着提取纯化技术得不断进步,高活性得菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工与食品领域。[１］利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶得获取途径与应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境得污染;随着市场对菠萝加工产品需求量得增大,对于菠萝皮得研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要得功能成分蛋白酶得分离、纯化与性质得研究更有意义、[２]
本文通过对菠萝皮蛋白酶得提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性得影响因素,并解决实验存在得一些问题、
1 实验材料与仪器
１、1实验材料与试剂
新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量８ 00０~１４ ０00),0。１mo1／Ｌ pH 7.8磷酸缓冲液配制(ＰBS),0.0１mｏ1/L pH 7。８磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mｍo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mｍo１/L EDTA—Na2 (乙二胺四乙酸二钠)],10%三氯乙酸(TCＡ)。 1、2 实验仪器
７2２型可见光分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司; ７52型光栅分光光度计:北京光学仪器厂; TＤL－６0B台式离心机:上海安宁科学仪器厂; D5Ｍ离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;
DK-８Ｄ电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司; 可控硅恒温水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司; AMPUT电子天平:深圳安普特科技有限公司; BS１１０S分析天平北京赛多利斯天平有限公司; ＤS—１型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;
HZS-H型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2 实验方法
2、１菠萝蛋白酶得粗酶提取
称取菠萝皮材料20ｇ,将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中,加入约6０ｍL预冷得0。１mo1／L pＨ ７.8 PBS,持续搅拌1０～１5min至粉碎,搅拌完成后用４层纱布过滤,得到滤液后,用冷冻离心机于4°C 300０rpm离心6min,弃沉淀,即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液得体积、蛋白质含量与酶活性。 2。2盐析
－,研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵,边加边搅拌,使溶液最终硫酸铵饱与度为3０%,放置于冰水混合物(４℃)30mｉn 后,酶蛋白沉淀析出,4°C ４000ｒｐm离心10min,收集沉淀, 加入0、1ｍｏ1／L ｐＨ ７、8 PＢS约15mL至完全溶解,测定其体积、蛋白质含量与酶活性、 2、３透析
将溶解液装入2、5 ｃm×8ｃm透析袋(预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30mｉn)中,于 5０0ｍL 烧杯中,在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析,15min换水一次,换水３~4次后,检查ＳＯ４２—就是否已被除净(检查得方法就是:取２mLＢaCl2溶液放入一支试管,滴加2~３滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示SO4２- 未除净,若无沉淀出现,表示透析完全)。若透析液有沉淀,将透析液用滤纸过滤,测定过滤液得体积、蛋白质含量与酶活性。
2.4酶活力测定方法
取2支试管,设置一支为实验对照,三支为平行样品。取0.1mL酶液,加入0、9ｍL激活剂,加入３7℃预热得1％酪蛋白溶液1mL,准确反应1０miｎ,加入10％三氯乙酸３mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液,后加酪蛋白溶液,其它与测定管相同。离心(３000ｒ／miｎ,５min)或过滤,清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义:在上述条件下 ,每10mｉn增加０。001个光吸收值为１个酶单位(Ｕ)。
实验步骤按照表格中完成、
表1 酶活测定步骤
试剂(mｌ) TCA 酶液 激活剂 酪蛋白
对照组 3 0、1 0、９ 1
平行样品1 — 0。1 0。9 1
3７°C准确反应１0ｍin
TCA
粗提
Ａ２80nm
- - — —
3 0、791
3 ０。81８
3
平行样品2 — ０、１ 0。9 1
平行样品3 — 0、1 0。9 1
0。８６8 0、9８6 0。８48
盐析
ＯD值
0.82３ 0、4
0。9０7 0。875
透析
2.5蛋白质含量测定方法
将酶液稀释至一定程度,采用考马斯亮兰G—250法测定溶液中可溶性蛋白得含量(参照附录1)、
３实验结果与分析
3。1 蛋白质含量计算
3、1.1标准曲线得绘制
表X 0-1000ｕg/ml标准曲线得绘制
管号
10０0μg/ｍL牛血清白蛋白
1 ０
２ 0、2
3
4
5 0。8
６ 1.0
０、４ 0、6
蒸馏水(mL) 蛋白质浓度(μg/mL) 吸光值(A5９5)
１、0 ０
0。８ 0。1５７
０。6 0。24５
0、４ 0、3９1
０、2 0 0、53５
０ 100０ 0、6５6
得到从1到6号管得牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、2０0、400、600、800、100０μg/mL,准确吸取各管溶液0.lmL,加入5mｌ考马斯亮蓝溶液,摇匀,静置２ｍin,测定５95ｎm吸光值,绘制０-1000μg／mL标准曲线。
0.70.60.5y = 0.0006x + 0.0104R² = 0.9942A5950.40.30.20.10020040060080010001200牛血清蛋白浓度(μg/mL) 图1 蛋白吸光值标准曲线
３、1.2样品得测定
准确吸取样品溶液0、1mL放入具塞刻度试管中,与步骤(1)操作相同,测得样品得光吸收值Ａ595ｎm、
3。1。3结果计算
由标准曲线可查出相应得蛋白浓度(μg/mL),可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
查出得蛋白提取液浓度(μg/mL)×定容体积(ｍL)
样品蛋白含量(μg/g鲜重)＝──────────────────────────────────────
样品重量(g)
样品蛋白质含量(粗提纯)=(５17、７×62)/20.０0＝1604。9(µg／g) 样品蛋白质含量(盐析)=(7０６×1６)/２0。００=56４。８(µｇ/g) 样品蛋白质含量(透析)=(１０17。7×1３)/20、0０=６６１、5(µg/g)
３、2酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验得平均值。 酶液活力(U/ｍL)= ×稀释倍数 0、001×0、步骤 粗提
A28０nm OD
空白 — - —
平行１ 平行２ 0。818
0、7９１
A280nm 平行３ 平均值 0.868 0。986 ０.848
0、8２6 ０。905 ０。８72
盐析
值
0。823 0。４
０、90７ 0。8７５
0.856×1
透析
粗酶液活力(Ｕ/mL)＝
A280nm×稀释倍数
0.001×0.10.001×0.1
=
0.001×0.1
=８257 U/mL =9053 U/ｍＬ ＝8723 Ｕ/ｍL
盐析酶液活力(U/mＬ)=
A280nm×稀释倍数A280nm×稀释倍数
0.001×0.1
=
0.905×1
0.001×0.1
透析酶液活力(U／mL)=3、3酶比活得计算
=
0.872×1
0.001×0.1
酶比活(U／mg· 蛋白)＝酶活力／酶蛋白质含量 粗酶比活(U/mg• 蛋白)=
酶活力酶蛋白质含量
酶活力酶蛋白质含量
酶活力酶蛋白质含量
=
82561.6049
=51４１、8(U／mg• 蛋白) ＝ １6０2９、3(U/mg• 蛋白)
盐析酶比活(U/mg• 蛋白)=透析酶比活(Ｕ/ｍg• 蛋白)=
= =
90530.5887230.6615
=131８3、2(U/ｍｇ• 蛋白)
3、４酶纯化过程中回收率计算
回收率(%)=(纯化酶总活力／粗酶液总活力)×1０0
= 〔(纯化酶活力×纯化酶液体积)/(粗酶活力×粗酶体积)〕×100
盐析回收率(％)=(9053×16.0)/(8256×6２、0)＝28。30％ 透析回收率(%)=(8723×13、０)/(8256×62。0)＝２2、15% 3。5酶纯化倍数得计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
盐析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=１6029.3/5141.8 =3.12 透析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=１31８3.２/5141。８ =2。56 3、6分析及讨论
将测定得数据整理计算分别填入下表,并菠萝蛋白酶得分离纯化效果进行分
析与讨论。
表Ｘ 菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤
总体积(ｍL)
总蛋白质含量(mｇ) 32、１2 11、30 13.2３ 总活力(U／mL)
比活力(U／mg蛋白)
回收率(%)
纯化倍数
粗提 6２ 盐析 1６ 透析 1３ 300002500020000150001000050000８25６、６7 5１41。78 9０5３。33 16029、27 8723.3３ 13１83、2１ - -
28、３０ 3。12 ２2。15 2。5６ 总活力（U/mL）比活力（U/mg·蛋白）粗提盐析透析 图x 菠萝蛋白酶活对比图
4 实验结论与讨论
本次实验菠萝蛋白酶经过了粗提纯、盐析及透析三个步骤得分离纯化,结果得到粗提纯得蛋白质浓度最高,透析后蛋白质浓度最高,盐析次之;理论上,粗酶蛋白浓度应该比偷袭盐析低。原因可就是盐析与偷袭操作不当导致菠萝蛋白酶损失严重,或者盐析后得沉淀无法完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低、
盐析以及透析后菠萝蛋白酶得活力比粗酶高,这可能就是因为未盐析透析之前,菠萝蛋白酶受例如金属离子等因素影响,导致蹙眉得酶活力与酶比活比盐析与透析低。
由菠萝蛋白酶分离纯化表可知,盐析与透析得到得酶回收率都不高、可能就是实验中加入得硫酸铵并没有充分溶解,导致局部硫酸铵含量过高,使得蛋白酶变性失活,最终影响蛋白酶得回收率、
在纯化倍数上,盐析得纯化倍数比透析得纯化倍数要高一些,这就是与两个处理环节得到酶活力及蛋白质含量有关,盐析后酶得浓度比透析得高,所以盐析
得纯化倍数会更高。
【思考题】
1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活?
酶得变性失活主要与有机溶剂、金属离子、高温、高酸碱等因素有关。所以在分离纯化时注意:①不能用自来水配制透析液;②不使用不清洁得仪器设备;③控制反应温度,避免高温。
2.常见得酶活性表示方法有那些(如:U/ＭL酶液;U/MG蛋白质; Ｕ/G干重或鲜重;Ｕ/Ｇ 酶粉 等)？它们各有什么含义,适用哪些场合？
U/ｍL酶液用来表示每单位体积酶液中得酶活力情况,适用于表示液体酶中得酶活力大小。U/mg蛋白质用来表示单位质量样品中得酶活力情况,适用于表示含一种或多种蛋白得样品中得酶活力大小。Ｕ／g干重或鲜重用来表示每克原始样品中得酶活力情况,适用于原始样品得酶活力表示、U/g 酶粉表示每克酶粉中得酶活力情况,适用于酶制剂得酶活力测定或者酶制剂得相应浓度配制。 3、蛋白质得沉淀作用还有哪些方法?哪些变性了?哪些没有变性？
沉淀蛋白质常用得方法:单宁沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂法、重金属法、生物碱试剂法。其中有机溶剂法、单宁沉淀法、重金属法、生物碱法往往会使蛋白质变性,等电点沉淀法通常不会使蛋白质变性。 ４。实验中硫酸铵盐析为什么要选择０%～30％饱与度？
在０－30％得饱与度范围内,菠萝蛋白酶得酶回收率随着饱与度得增大而增大,当超出这个范围时菠萝蛋白酶得回收率降低。因此,本次实验选择在盖饱与度范围内进行盐析处理。[3］
参 考 文 献
［１］吴茂玉,马超,乔旭光,宋烨,赵岩。菠萝蛋白酶得研究及应用进展［Ｊ]、食品科技,2008(08):１7—2０。
[2]陈伟杰。 菠萝皮蛋白酶得制备、特性及应用得研究［D］、 锦州医科大学, 2016。
[3]梁宏宇. 菠萝蛋白酶提取方法得研究[Ｄ］.广西民族大学,20１2.
原始数据
1。测定体积
步骤 粗提取 盐析 透析
总体积(mL) 61+1 1５+1 1３
2.考马斯亮兰G－2５0法测定溶液中可溶性蛋白得含量
A５９５nm OD
步骤 粗提
空白组 — — —
平行1 0、321
平行2 ０、４81
平行3 0、487 ０、360 0。４78
盐析
值
０.４34 0.62１
０.456 0.６7８
透析
3。酶活测定
步骤
粗提
Ａ280ｎm OD
- - —
0。７９1
0。８１8
空白
平行1
平行２
平行3
0.8６８ 0。986 0。8４８
盐析
值
０。８23 0、4
0.907 ０.87５
透析