流式细胞仪

计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 * 1 原理

* 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 原理

一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。 可以检测的参数有：

细胞的体积和形态复杂程度 、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、 RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染） 、蛋白质 、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原 、酶活性 、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势 、膜流动性 细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、 细胞存活能力 、监测细胞电通透性 、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽 、各种组合（DNA/表面抗原等等） 流式细胞仪(flow cytometer)

流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。 现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。

流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分：

* 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。

* 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、偶极激光（蓝、绿、红、紫）。

* 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统，线性或对数放大。 * 计算机，用于分析信号。

早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同，主要的厂商和品牌如下：

* Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms)

* Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform)

* Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) 应用

流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中，

它主要用于荧光标记的抗体。特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的特别信息。这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用。 现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。

流式细胞仪也是很有用的分选仪器。当细胞/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。

由流式细胞仪得到的数据可以画成一维的柱状图或者二位或者三维的散点图。

The data coming from flow-cytometers can be plotted in 1-D to produce histograms or seen in 2D as dot plots or in 3D with newer software. The regions on these plots can be sequentially separated by a series of subset extractions which are termed gates. Specific gating protocols exist for diagnostic and clinical purposes especially in relation to haematology. The plots are often made on logarithmic scales. Because of overlaping fluorescent dyes, emission spectrum generated interfering signals by detectors signals have to be compensated electronically.

海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻(Prochlorococcus)就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。 [编辑] 参见 * 荧光显微镜 * 荧光活化细胞分选

2、流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测

(摘自 免疫学论坛) 流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测 激活的淋巴细胞内细胞因子的检测 简介

细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。近来研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。

早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－γ）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。在细胞水平该方法证明了

人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。

一、仪器设备

1． 12×75mm有盖的Falcon管（BD Catalog No.2058） 2． 37℃孵箱5％CO2 3． 混匀振荡器 4． 离心机

5． 加样、Tips 6． FACS流式细胞仪

二、细胞 1、全血

使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAINER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs) 使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。

3、 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)

用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－10。

4、 细胞系与T细胞克隆

调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。

5、冰冻全血与PBMCs

应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1％的BSA及10％的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液 通透与染色。 三、刺激试剂与抗体

1、PMA（Sigma catalog No.P-8139）

打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1mg包装的小瓶，打开迅速加入1ml的无水乙醇或DMSO。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1.5ml的e.p.管中,每管10μl,取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。

2、离子霉素Ionomycin(Sigma catalog No.I-0634) 打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100支1.5ml的e.p.管中，每支10μl，取出1支待用，其余19支冻存于-70℃或-20℃冰箱，

3、Golgistop或Golgiplug,（catalog No.555029或554724） 详细请见说明书

4、所需相应的抗体，如CD4、CD8、CD3、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、CD69等。

最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血

5、离子霉素：1μg/ml全血

6、FACS溶血素 FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：

(1) 全血制备时用于溶解红细胞 (2) 固定外表位 (3) 辅助通透剂

FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。 7、FACS通透液

BD推出FACS通透液（BDIS Catalog No.340973）以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。 FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。

8、DMSO、乙醇、洗液PBS（含1%BSA与0.09%NaN3）, RPMI10, 4℃储存。

9、细胞内染色的标记荧光单抗试剂

依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记IFNγ-FITC/IL-4PE与

CD3PerCP组合是同时研究TH1与TH2型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。

四、对照

正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确

认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。

1、 未刺激对照

未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与10μg/mLBFA或莫能霉素共孵育，不加刺激剂。

2、 同型对照

同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗-KLH同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。

3、 激活对照

激活对照使用细胞表面表达CD69 来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

a. 取部分血样加PMA+I但是不加莫能霉素或BFA（抑分泌试剂如BFA会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测）。

b. 表面染色CD69PE/CD3PerCP，省略通透与胞内染色步骤。

c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，表面CD69染色阳性率应在90%以上。

4、 胞内染色对照

胞内染色对照通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。

a. 取部分血样加PMA+I+Golgistop

b. 省略表面染色，胞内染色CD69PE/CD3PerCP（BDIS Cat.No.340368） c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，胞内CD69染色阳性率应在90%以上。

五、样品的激活与染色：（以Th1和Th2的检测为例）

激活时由于莫能霉素的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含莫能霉素。激活过程在有盖的Falcon管中进行。

1、 取五支有盖的Falcon管，编号1、2、3、4、5，前四支为对照，第五支是样品检测管，分别取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 X 106 ）500μl，加入500μl RPMI10进行稀释一倍，每支管中加入上述刺激剂，混匀。 最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血 离子霉素：1μg/ml全血 BFA：10μg/ml全血 莫能霉素:3μm/ml全血

2、37 0C，5%CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖)

3、取出Falcon管，用PBS洗两遍，1200转，离心5分钟。慢慢吸出上清。 4、胞外染色：1、2、5管中加入20μl 如CD3、D4-PerCP,3管加入 CD69-PE+CD3-PerCP抗体混匀，室温避光15分钟。

5、溶血：每管加入10X的溶血素2ml，室温避光10分钟。取出，1200转，离心5分钟。弃上清。

6、破膜通透：3、管省去破膜通透及胞内染色。1、2、4、5管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2ml含0.5BSA的PBS，1000转，离心5分钟。弃上清。

7、胞内染色：1、2、4、5管中加入上表内的抗体。混匀，室温避光30分钟。加入2ml含1%BSA的PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。

8、上机检测：加入0.5ml的鞘液，在CellQuest软件下，获取10万个细胞。 应用BD FACS流式细胞仪分析。

使用CaliBRITE标准微球，调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度。

用CellQuest获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10万细胞。 设门圈定FL3+细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用

CellQuest，Attractors分析数据。PMA激活时，血小板可能会被圈在FL3门内，此时可以用FSC/SSC设门。以CD4设阈值时，以FSC/SSC设门可以排除单核细胞。

特异性结果的计算

公式：（AS-AIC）-（US-UIC） AS： 激活样本

AIC：激活同型对照 US：未刺激样本

UIC：未刺激同型对照

3、流式细胞技术

流式细胞技术（Flow Cytometry）是先进的细胞定量检测检测技术,它已在血液学、免疫学、细胞凋亡、活细胞表面特异分子鉴定等生命科学领域得到广泛运用。

图1 流式细胞技术原理

奇悟生物采用fluorescence-activated cell sorter (Becton Dickinson)

流式细胞仪，可提供相关的全套流式细胞技术服务，主要包括以下几方 1） DNA倍体分析、DNA含量分析、细胞周期、细胞凋亡。

2） 细胞表面抗原分析：淋巴细胞免疫分型如CD34、CD33、CD19、CD45

等。 3） 血小板功能的测定:CD62P 、CD41a 4) 细胞氧化状态测定（ROS）

图2 流式细胞技术分析结果