维普资讯 http://www.cqvip.com 国际检验医学杂志２００７年１１月第２８卷箜 塑 ！ｎＩ 望 ： ！！ Ｑ ！！ ：垫！ ・经验交流・ 鲍曼不动杆菌的基因分型及其应用 王苏建 虞丽娟 王家平 王仕忠 【摘要】 目的 运用重复片段引物ＰＣＲ对鲍曼不动杆菌进行基因分型，了解鲍曼不动杆菌的基 因同源性。方法 选用肠杆菌科基因问的重复序列（ＥＲＩＣ）为引物进行ＰＣＲ扩增，对２４株鲍曼不动 杆菌进行分型，并与药敏结果进行比较。结果 用ＥＲＩＣ－ＰＣＲ方法将鲍曼不动杆菌分为１Ｏ种基因 型，抗生素表型有４种。结论该方法简便易行，且重复性好。适合于医院流行病学研究。 【关键词】鲍曼不动杆菌； 基因分型； 多聚酶链反应 中图分类号：Ｒ３７８．９９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７３—４１３０（２００７）１１—１０２９ ０２ 在非发酵菌中，不动杆菌在临床标本中的分离阳性率仅次 国临床实验室标准化委员会标准。（３）ＤＮＡ制备：将菌株接种 于铜绿假单胞菌。不动杆菌为医院感染常见病原菌，该菌广泛 于肉汤培养基中，３５℃培养２４ ｈ。取菌液３００ ｌ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 存在于自然界、医院、人体皮肤、消化道及呼吸道内，是引起医 离心５ ｍｉｎ，弃上清，沉淀物加生理盐水洗涤３次，弃上清。加 院感染的重要条件致病菌 ，其中最常见的是鲍曼不动杆 裂解液５Ｏ ｌ，１００。Ｃ煮沸１５ ｍｉｎ。１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取 菌 ，日前多重耐药的鲍曼不动杆菌已成为医院感染的重要 上清２ ｌ做为反应模板。（４）反应体系总体积２５ ｌ。其中引 病源菌，常引起呼吸道、尿道及伤口感染、脑膜炎、中耳炎和菌 物２ ｐｌ（０．２ ｐｍ）、ＤＮＡ摸板２．０ ｌ、１０Ｘｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ”）２５ ｌ、 血症等 。特别是重症监护病房内感染的暴发流行 ］，因此 ｄＮＴＰｓ ２．０ ｔｌｆ（２００ ｍ）、Ｔａｑ酶１Ｏ ｌ、双蒸水１５．５ ｌ。（５）扩 对鲍曼不动杆菌的基因同源性研究具有重要的分子流行病学 增条件：９４℃预变性５ ｍｉｎ，后设９４℃４５ Ｓ、５３℃４５ ｓ、７２。Ｃ １ 意义。为了解我院鲍曼不动杆菌的基因同源性，我们采用肠杆 ｍｉｎ ３５次循环后７２℃延伸６ ｍｉｎ。（６）产物检测：取５ ｌ扩增 菌科基因间重复序列ＰＣＲ（ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒｉａｔ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ 产物，用１％琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，主条带位置和数量相 ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ，ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）对临床分离的２４株细菌基因组ＤＮＡ 同为同一基因型。 进行了分型，现报道如下。 结 果 材料与方法 １．２４株鲍曼不动杆菌药敏模式分型，见表１。 １．材料：（１）菌株：２００５年９月～２００６年３月从本院临床 表ｌ ２４株鲍曼不动杆菌药敏模式分型 患者痰液、尿液、分泌物中分离的２４株鲍曼不动杆菌。质控菌 株：大肠埃希菌ＡＴＣＣ ２５９２２。（２）药敏纸片：阿米卡星（丁）、 萘啶酸（萘）、氨曲南（南）、复方新诺明（复）、头孢噻吩（吩）、亚 胺培南（亚）、环丙沙星（环）、阿奇霉素（阿）、头孢吡肟（马）、头 孢孟多（孟）等１Ｏ种细菌药敏纸片，均由杭州天和微生物试剂 有限公司提供。（３）主要试剂根据文献［６］合成引物序列为 ＥＲＩＣＩ ３ ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＧＧ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＡ ＴＧＴ Ａ ５ ＥＲＩＣ ２ ３ＧＣＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＣＡ Ａ ５ 、１０ ｂｕｆｆｅｒ ２．ＥＲＩＣ－ＰＣＲ基因分型图谱，见图１。 （Ｍｇ ）、缓冲液、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶均由上海生工生物工程技术 服务有限公司提供，裂解液购于华美生物工程有限公司。（４） 主要仪器：法国Ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ公司生产的Ｖｉｔｅｋ．３２型全自动细 菌培养鉴定仪；美国ＡＢＩ公司生产的ＡＢ１７０００基因扩增仪；上 海复旦高科技有限公司生产的ＦＸ—ＢＹ一２５２型电泳仪；凝胶成 像系统为美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司生产。 ２．方法：（１）菌株鉴定：所有鲍曼不动杆菌经全自动细菌鉴 定和药敏试验系统（Ｖｉｔｅｋ３２）鉴定仪用革兰阴性杆菌鉴定卡鉴 定。（２）药敏实验用纸片扩散法（Ｋ Ｂ法）测定对阿米卡星、萘 啶酸、氨曲南、复方新诺明等抗生素的敏感性，结果测定参照美 图１ ＥＲＩＣ－ＰＣＲ基因分型图谱 ３．２４株鲍曼不动杆菌抗生素敏感实验结果和ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分 作者单位：２１３００３江苏省常州市第二人民医院检验科 型结果，见表２。 维普资讯 http://www.cqvip.com
・１０３０・ 垦 匿堂壅查２∞７年Ｉ１月第ｚ８卷第１１期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００７，Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．１１ 表２ ２４株鲍曼不动杆菌抗生素敏感实验和 ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型结果 讨 论 基因同源性分析的有效性因微生物种类的不同而存在差 异 ］。本文ＥＲＩＣ－ＰＣＲ结果显示，２４株鲍曼不动杆菌分为１Ｏ 种基因型，片段大多在５０￣３００ ｋｂ范围内。其中以Ａ（８株）、Ｂ （６株）型为主。由表２可知ＥＲＩＣ—ＰＣＲ的分辨力明显强于药 敏表型。另外，菌株表现型相同，基因型可以不同，基因型相 同，菌株表现型也可以不同。 目前，用于鲍曼不动杆菌同源性分析常用的方法有脉冲场 凝胶电泳、随机引物扩增ＤＮＡ多态性和ＥＲＩＣ＿ＰＣＲ。脉冲场 凝胶电泳分辨力高，是目前细菌分型的金标准，但此设备价格 极为昂贵，一般实验室不具备；且此方法费时费力，故不易推 广 。．９］。 随机引物扩增ＤＮＡ多态性虽然具有快速、简便、省时、省 力的优点，但它选择的引物短，在低温退火温度下与模板进行 随机扩增，因此产生的非特异性条带较多，影响结果；且该技术 尚未进行统一化和标准化，因而难以对不同实验室的结果以及 流行菌株特征进行比较。 ＥＲＩＣ是常用的一类引物，长度为１２６ ｂｐ，位于染色体上 非编码转录区，不同细菌ＥＲＩＣ在染色体上的位置不一样。所 以ＥＲＩＣ－ＰＣＲ其分辨力较随机引物扩增ＤＮＡ多态性强，与脉 冲场凝胶电泳具有相关性，结果可靠，是目前常用的简便、快速 的基因分型技术，同一对引物也适用于其他革兰阴性杆菌的分 型，适合于一般实验室常规开展。同时，对临床分离的同种菌 株进行分型，对于流行病学的调查、切断传染源和传播途径有 着重要的临床意义，有利于临床上判断是否暴发某种细菌感 染，从而及时采取相应措施阻止耐药菌进一步扩散。因此，在 医院流行病学调查与临床细菌分型中具有较好的应用前景。 参 考文 献 ［１］张庆玲，刘明华，王仙园，等．泰能和氨苄西林／舒巴坦治疗鲍曼 不动杆菌感染的临床研究ＥＪ］．第三军医大学学报，２００３，２５（７）： ６３２－６３４． Ｅ２］刘锡光，主编．现代诊断微生物学ＥＭ］．北京：人民卫生出版社， ２００２．４３６—４６２． ［３］陈东科，彭红，张秀珍．医院内不动杆菌产酶耐药表型研究［Ｊ］． 临床检验杂志，２００４，２２（１）：２８—３１． Ｅ ４３ Ｃａｒｂｏｎｎｅ Ａ，Ｎａａｓ Ｔ，Ｂｌａｎｃｋａｅｒｔ Ｋ。ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｓ－ ｏｃｏｍｉａｌ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ＶＥＢ－１一 ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｉｎ ａ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｓｅｔｔｉｔ￣ｇ ＥＪ］．Ｊ Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ，２００５，６０（１）：１４—１８． Ｅ５］Ｊｅｏｎ ＢＣ，Ｊｅｏｎｇ ＳＨ，Ｂａｅ ＩＫ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｉｍｉｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｐｒｏｄｕ— ｃｉｎｇ ｔｈｅ ＯＸＡ－２３ ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎ ｋｏｒｅａＥＪ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ， ２００５，４３（５）：２２４１—２２４５． －１６］夏云，张玉洪，曹何，等．应用重复ＰＣＲ指纹技术调查肺科ＩＣＵ 鲍曼不动杆菌的暴发流行ＥＪ］．陕西医学检验，２０００，１５（１）：１６— １８． Ｅ７３ Ｃａｒｔｅｌｌｅ Ｍ，ｄｅｌ－Ｍａｒ－Ｔｏｍａｓ Ｍ，Ｐｅｒｔｅｇａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ－ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｅｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２（９）： ４２４２－４２４９． Ｅ８］Ｙｏｏ ＪＨ，Ｃｈｏｉ ＪＨ，Ｓｈｉｎ ＷＳ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔ—ｒｅ— ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ—ｓｉｔｅ ＰＣＲ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｕｍａｎｎｉｉ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７（１０）： ３１０８－３１ １２． ［９］Ｓｕ ＬＨ，Ｌｅｕ ＨＳ，Ｃｈｉｕ ＹＰ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌ・’ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉ—。ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｕｓｉｎｇ ｐｕｌｓｅｄ—ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＣＲ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＧｒｏｕｐＥＪ］．Ｊ Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ，２０００。４６（２）：１１０一ｌｌ７． （收稿日期：２００７－０２—１４）