春尺蠖NPV生物学特性及室内增殖研究

中国森林病虫　２０１１年１１月　第３０卷第６期　・３５・　春尺蠖ＮＰＶ生物学特性及室内增殖研究　曲良建　，王玉珠　，陶婧　，张永安　（１．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所国家林业局森林保护学重点实验室，北京１０００９１；　２．西北农林科技大学，陕西杨凌７１２１００）　摘要：春尺蠖核型多角体病毒（却ｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＡｃｉＮＰＶ）是春尺蠖的主　要病原微生物。该文研究了ＡｃｉＮＰＶ的形态结构和室内生物活性，及ＡｃｉＮＰＶ室内生产过程中的　适宜感染浓度、感染虫龄和感染温度，从而为该病毒今后的商业化生产和应用提供借鉴。　关键词：春尺蠖；核型多角体病毒；增殖；生物活性　中图分类号：￥７６３．４２文献标志码：Ｂ文章编号：１６７１—０８８６（２０１１）０６—００３５—０３　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　Ｅｒｓｃｈｏｆｆ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉ－　ｒｕｓ　ｉｎ　ｌａｂ／ＱＵ　Ｌｉａｎｇｊｉａｎ，ｅｔ　ａ１．（Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣＡＦ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　Ｅｒｓｃｈｏｆｆ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ａｎｄ　ｂｉｏａｓｓａｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｓｔａｒｓ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｍｕｌｉｔｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ，　ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｈｔｅ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　Ｅｒｓｃｈｏｆｆ；ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　春尺蠖Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　Ｅｒｓｃｈｏｆｆ又名杨尺　工程技术有限公司提供。　蠖、沙枣尺蠖。国内主要分布于、青海、甘肃、陕　１．２方法　西、宁夏、内蒙古、河北、天津、河南、山东等地区，国　１．２．１　ＡｃｉＮＰＶ室内增殖与纯化取室内冰箱保　外主要分布于前苏联和中亚细亚地区¨Ｉ２　Ｊ。近年　存的ＡｃｉＮＰＶ毒株，以３．０×１０　ＰＩＢ／ｍＬ的浓度感　来，由于全球气候的变化，单树种人工林大面积种　染健康的３龄初春尺蠖幼虫。５　ｄ后收集具有典型　植，再加上不同地区间交流贸易日益频繁，春尺蠖相　病毒死亡症状的病死虫尸，研磨匀浆后３层纱布过　继在、青海、内蒙古和等地区大面积发生，　滤。经多次差速离心后蒸馏水悬浮沉淀，即为初步　严重威胁当地的自然景观和生态环境。　纯化的ＡｃｉＮＰＶ。用血球计数板方法计数后贴上标　春尺蠖核型多角体病毒（Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　签在４℃冰箱中保存备用。　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＡｃｉＮＰＶ）是春尺蠖的重要病原　１．２．２　ＡｃｉＮＰＶ的电镜观察取适量ＡｃｉＮＰＶ用蒸　微生物，对春尺蠖具有较好的控制效果，且能够在寄　馏水悬浮，经涂片、干燥和喷金后在ＤＭＳ一６３６０ＬＺ　主种群中形成流行病进而长期控制其种群数量，是　型扫描电镜下观察多角体形态。ＡｃｉＮＰＶ多角体超　防治春尺蠖的理想生物杀虫剂。作者研究了ＡｃｉＮ．　薄切片的制备及投射电镜观察方法见参考文　ＰＶ的生物学特性和增殖技术，以期为该病毒将来的　献［３］。　产业化生产和应用提供借鉴。　１　试验　收稿日期：２０１１一Ｏ７—１Ｏ　基金项目：级公益性科研院所基本科研业务费（ＣＡＦＲＩＦ２００７１５）；　１．１　材料ＡｃｉＮＰＶ毒株由中国林业科学研究院　林业行业专项（２００７０４００３）　森林生态环境与保护研究所生物防治研究室保存，　作者简介：曲良建（１９７７一），男，河南南阳人，助理研究员，硕士，主　要从事林业害虫生物防治研究。　春尺蠖试虫及试虫人工饲料由北京中林恩多威生物　通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：Ｚｈａｎｇｙａｂ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃａ　・３６・　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｅｓｔ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ＮＯＶ．　２０１　１　Ｎｏ．６　１．２．３　ＡｃｉＮＰＶ室内生物活性测定取纯化后的　ＡｃｉＮＰＶ多角体悬浮液，依次稀释为１．０×１０　，１．０　Ｘ　１０　，１．０　Ｘ　１０　，１．０　Ｘ　１０　，１．０　Ｘ　１０　ＰＩＢ／ｍＬ　５个浓　度梯度，另设１组蒸馏水对照，每个处理５０头，重复　３次。无菌环境下每个养虫杯接人２００　Ｌ的病毒　液，自然晾干后每个养虫杯放入健康３龄幼虫１０　头，４８　ｈ后更换无病毒新鲜人工饲料，培养箱温度　设置为（１８±０．５）℃，光照１４　ｈ。逐Ｆｔ记录不同处　理幼虫死亡数，试验数据用ＥＸＣＥＬ处理分析。　１．２．４　ＡｃｉＮＰＶ室内增殖技术研究　１．２．４．１　虫龄与病毒产量相关性试验　取纯化后　的ＡｃｉＮＰＶ多角体并稀释至１．０　Ｘ　１０　ＰＩＢ／ｍＬ，分别　感染２，３，４龄春尺蠖幼虫，每个龄期幼虫５０头，重　复３次，培养箱温度控制在（１９±０．５）℃，光照　１４　ｈ。分别收集不同龄期感病虫体一２０℃条件下　保存，试验结束后计算不同龄期幼虫单头产毒量。　１．２．４．２感染浓度与病毒产量相关性试验分别　用１．０　Ｘ　１０　，１．０　Ｘ　１０。，１．０　Ｘ　１０　ＰＩＢ／ｍＬ　３种浓度　的ＡｃｉＮＰＶ感染４龄春尺蠖幼虫，每种浓度５０头，　重复３次，温度及光照条件同１．２．４．１。分别收集　不同处理的感病虫体一２０℃条件下保存。试验结　束后计算不同处理的幼虫单头产毒量。　１．２．４．３温度与病毒产量的相关性试验在４组　不同温度下（１７±０．５），（２２±０．５），（２７±０．５），　（３２±０．５）℃用相同浓度（１．０　Ｘ　１０　ＰＩＢ／ｍＬ）的　ＡｃｉＮＰＶ感染４龄春尺蠖幼虫，每个温度５０头，重复　３次，试验结束后分别收集感病虫体一２０℃条件下　保存并计算不同处理的幼虫单头产毒量。　２结果与分析　２．１　ＡｃｉＮＰＶ形态观察从扫描电镜可以看到，　ＡｃｉＮＰＶ多角体多为近三角形，少数近圆形或不规　则形，表面有的光滑，有的呈现层状，个别有杆状凹　窝，其直径在０．４２～１．８９　ｐ．ｍ之间，平均为１．２０—　１．４５　ｍ（图１）。透射电镜表明，ＡｃｉＮＰＶ为单核衣　壳多角体病毒（Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＳＮＰＶ），多角体中包埋着多个杆状病毒粒子，　病毒粒子大小约为（１５—２７）ｎｍ　ｘ（１２５～２２５）ｎｍ，　在多角体中呈零散无规则排列状（图２）。　２．２　ＡｃｉＮＰＶ室内生物活性春尺蠖幼虫对ＡｃｉＮ—　ＰＶ敏感，幼虫感染浓度与死亡率正相关，其浓度对　数值与死亡机率值的回归方程为：Ｙ＝０．６５６　９ｘ＋　１．９８５　８（，．：０．９９），感染３龄幼虫的致死中浓度为　３．８８　Ｘ１０　ＰＩＢ／ｍＬ（表１）。　图１　ＡｄＮＰＶ多角体扫描电镜图（１０　０００×）　图２　ＡｃｉＮＰＶ多角体透射电镜图（６０　０００×）　表１　ＡｃＩＮＰＶ感染春尺蠖３龄幼虫死亡率与杌率值　２．３　ＡｃｉＮＰＶ室内增殖技术研究　２．３．１　ＡｃｉＮＰＶ适宜感染虫龄　在春尺蠖幼虫４　龄时接种ＡｃｉＮＰＶ获得的病毒多角体产量最大，为　２．７６×１０　ＯＢｓ／头，约为幼虫２龄时接种的产量的５　倍，３龄幼虫的３倍（表２）。在春尺蠖幼虫２龄和３　龄时接种ＡｃｉＮＰＶ，虽然幼虫死亡率较高，但由于幼　虫虫体较小，死亡时间相对较快，病毒增殖时间相对　较少，从而导致病毒产量较低。因此，生产中可采用　感染４龄幼虫进行病毒的增殖，以便获得理想的病　毒产量。　表２感染虫龄与ＡｃｉＮＰＶ增殖量的关系　２．３．２　ＡｃｉＮＰＶ适宜感染浓度用１．０　Ｘ　１０７　ＰＩＢ／ｍＬ　中国森林病虫　２０１１年１１月　第３０卷　第６期　・３７・　浓度接种４龄春尺蠖幼虫时收获病毒多角体的产量　泛应用于生产实践　Ｊ，展现出良好的应用前景。　最高，平均单头产毒量为３．００　Ｘ　１０　ＯＢｓ！头，幼虫死　但是，ＡｃｉＮＰＶ在生产和大面积应用过程中也存在　亡率为９２．６８％（表３）。此外，从表中还可看出，不　一定问题，主要体现在生产和林间大面积推广应用　同处理之间病毒多角体产量差别不是很大，因此，生　方面。　产过程中可采用１．０×１０６　ＰＩＢ／ｍＬ～１．０　Ｘ　１０　ＰＩＢ／ｍＬ　１）ＡｃｉＮＰＶ生产中的技术瓶颈。春尺蠖１　ａ发　的浓度作为适宜的感染浓度。　生１代，以蛹在土中越夏、越冬，直至翌年２月或３　表３感染浓度与ＡｄＮＰＶ增殖量的关系　月才羽化出土。春尺蠖这一特性极大了ＡｃｉＮ—　ＰＶ的室内连续生产和林间大面积应用。因此，如何　解除春尺蠖蛹期滞育，实现ＡｃｉＮＰＶ室内连续规模　化生产已成当务之急，也是生产中迫切需要解决的　问题，这对ＡｃｉＮＰＶ将来的产业化生产和春尺蠖的　可持续控制具有重要意义。　２．３．３　ＡｃｉＮＰＶ适宜增殖温度　温度过低或过高　２）ＡｃｉＮＰＶ推广应用中的技术瓶颈。昆虫病毒　作为一类重要的微生物杀虫剂，具有寄主单一，对环　均不利于病毒的增殖。病毒适宜增殖温度应控制在　２２℃左右，此时单头幼虫产毒量可达７．４７×　境和人畜安全，持续控害效果明显等优点，但同时也　１０。ＯＢｓ／头（表４）。试验中发现，温度较高时，多数　有生物杀虫剂普遍具有的缺点，如杀虫速度慢，易受　外界环境条件影响和防效不很稳定等。因此，加快　幼虫干缩而死，说明高温对春尺蠖幼虫的生长发育　及病毒的增殖具有一定抑制作用；而温度过低，对幼　对ＡｃｉＮＰＶ和其它生物杀虫剂的剂型开发研究，研　虫的生长发育也具有一定抑制作用，亦不利于病毒　制出抗逆性强、效果稳定且易于使用的新剂型也是　的增殖。　目前生产中迫切需要解决的难题。　表４温度与病毒增殖量的关系　参考文献：　［１］萧刚柔．中国森林昆虫［Ｍ］．北京：中国林业出版社，１９９２：８９０　—８９１．　［２］　余吴，王登元，王运兵，等．春尺蠖种群空间格局的地质统计学　分析［Ｊ］．云南农业大学学报，２００６，２１（３）：３０３—３０６．　［３］杨苗苗，李孟楼，曲良建，等．南华松叶蜂病毒ＤｎＮＰＶ的发现　及其毒力测试［Ｊ］．林业科学，２００７，４３（７）：１３８—１４１．　［４］李兴龙，盂化民．春尺蠖Ａｐｏｃｈｅｉｍａ　ｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ　Ｅｒｓｃｈｏｆｆ种群厦　３讨论　量与抗ＡｃｉＮＰＶ毒力的关系［Ｊ］．内蒙古林业科技［Ｊ】，１９９５　（３）：２７—３２．　昆虫病毒作为一类防治和害虫种群数量变　［５］　齐跃强．核多角体病毒（ＡｃｉＮＰＶ）防治杨树春尺蠖试验［Ｊ］．陕　动的重要微生物杀虫剂，在害虫综合治理中占有重　西林业科技，２００６（２）：５０—５２．　要地位。随着人们生活水平的提高和对生态环境的　［６］　张永安，王贵成，徐保民，等．和田地区利用ＡｃｉＮＰＶ病毒　关注，该类生物杀虫剂越来越受到人们的青睐。　防治春尺蠖试验报告［Ｊ］．林业，２００２（２）：２０—２２．　ＡｃｉＮＰＶ作为防治春尺蠖的理想生物杀虫剂，已广　（责任编辑王瑞红）　（上接第２７页）　［７］丁岩钦．昆虫数学生态学［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９４：２２—　［５］刘文爱，范航清．广西红树林主要害虫及其天敌［Ｍ］．南宁：广　１３４．　西科学技术出版社，２００９．　［８］李开仁，邵崇斌，戴建昌．华山松大小蠹空间格局及最佳模型　［６］　兰星平．ｍ　／ｖ指标在判断昆虫种群空间分布型中的应用　的研究［Ｊ］．西北林学院学报，１９９７，１２（增）：７１－７９．　［Ｊ］．林业科学，１９９２，２８（４）：３８６—３８８．　（责任编辑赵杰）