华 南 师 范 大 学 实 验 报 告
学生姓名 林 鸿 锦 学 号
专 业 综合理科二班 年级、班级 07级 课程名称 生物化学实验 实验项目蛋白质等电点测定和沉淀反应 实验类型 □验证 □设计 □综合 试验时间 2008 年 9 月 22 日 实验指导老师 陈 文 利 实验评分
一、目的
1、了解蛋白质的两性解离性质
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质溶液稳定因素的认识
4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义
二、原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点.在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性.
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜鸡蛋
（二）试剂
（1） 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液
（2） 醋酸溶液（0.01 mol/L、0.10 mol/L、1.00 mol/L）
（3） 蛋白质溶液 ——5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清 ：水=1:9） （4） pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 （5） 3%银溶液 （6） 5%三氯乙酸溶液 （7） 95%乙醇
（8） 饱和硫酸铵溶液 （9） 硫酸铵结晶粉末 （10） 0.1mol/L盐酸溶液 （11） 0.1mol/L氢氧化钠溶液 （12） 0.05mol/L碳酸钠溶液 （13） 甲基红溶液 （14） 氯化钠固体
（三）器具
（1） 移液管（1mL、2mL、10mL）及洗耳球 （2） 试管及试管架
四、步骤与结果
（一）酪蛋白等电点的测定
取同样规格的试管4支，编号，按下表顺序分别精确地加入各试剂，混匀。然后向四支试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。静置10分钟后，观察其混浊度。详见下表：（“+号越多表明溶液越浑浊） 试剂 试管号 1 2 3 4 蒸馏水 （mL） 8.4 8.7 8.0 7.4 0.01mol/L 醋酸（mL） 0.6 -- -- -- 0.1mol/L 醋酸(mL) -- 0.3 1.0 -- 1.0mol/L 醋酸(mL) -- -- -- 1.6 pH 5.9 5.5 4.7 3.5 溶液浑浊度 + +++ ++++ + 【现象解释】由上面结果可知，3号试管最浑浊，因此说明酪蛋白的等电点为4.7。
（二）蛋白质的沉淀及变性
1、蛋白质的盐析
加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解。
将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2、重金属离子沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解。
3、某些有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
4、有机溶剂沉淀蛋白质
取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇，观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点氯化钠固体，混匀）。
1-4实验现象总结 操作 振荡、静置 倾去上清液，加水 蛋白状况 试剂 50%硫酸铵 饱和硫酸铵 3%银 5%三氯乙酸 95%乙醇 白色沉淀 白色沉淀 肉色沉淀 白色沉淀 白色沉淀 溶解 溶解 不溶解 不溶解 不溶解 析出球蛋白 析出清蛋白 变性 变性 变性 【现象解释】①硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等无机盐的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
②重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
③某些有机酸、有机溶剂能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质因变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
5、乙醇引起的变性与沉淀
取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂。振摇混匀后，观察各管有无沉淀生成。沉淀程度见下表： 试剂/mL 蛋白质 0.1mol/L氢 试管号 溶液 氧化钠溶液 1 2 3 1 1 1 -- 1 -- 2、3号各加一滴甲基红 0.1mol/L盐 PH4.7缓冲 95%乙醇 沉淀程度 酸溶液 溶液 -- -- 1 1 1 1 1 -- -- ++++ + ++ 各加数滴0.1mol/L盐酸 再按下表加入试剂，现象如表： 操作 各加水8mL 试管号 2号用0.1mol/L醋酸、3号用0.05mol/L碳酸钠中和 1 不溶解 -- -- 红，沉淀溶解 2 不溶解 呈浅黄色 橙红色→红，沉淀增加 红，沉淀溶解 3 不溶解 呈红色 橙红色→黄，沉淀增加→减少 红，沉淀溶解 【现象解释】①1号管处于蛋白质的等电点，2、3号则分别处于偏碱、偏酸环境。溶液中有乙醇，1号管沉淀明显，而本应只有微量沉淀的2、3号管，也出现了少量沉淀，推测乙醇会使蛋白质变性产生沉淀。
②在各试管中加入水，沉淀不溶解，证明了①中推测。
③加入甲基红，2号管原来为碱性，因此溶液呈浅黄色；而3号管原来为酸性，因此溶
液呈红色。
④2号管用醋酸中和，溶液由偏碱逐渐到中性，再到酸性。因此溶液由黄色到橙黄色再到红色。当溶液pH逐渐接近等电点时，沉淀也慢慢增加。3号管用碳酸钠中和，溶液由酸性到中性到偏碱，因此颜色由红到橙黄再到浅黄。当pH达到等电点时沉淀最多，趋向中性时又会慢慢减少。
⑤各试管加入盐酸，溶液呈较强酸性，因此呈红色，且此时pH小于等电点，蛋白质溶解。
五、讨论
（一）蛋白质沉淀反应中的两个特别现象的分析
【现象一】半饱和的(NH4)2SO4溶液可使球蛋白发生沉淀 ,而饱和的(NH4)2SO4溶液可使清蛋白发生沉淀从而可使两种蛋白质被分离。若把饱和的(NH4)2SO4溶液存放到了冰箱的冷藏室(2℃～3℃),第二天再用由它制成的半饱和溶液沉淀球蛋白时,蛋白质沉淀会一现即逝,又变成透明溶液,沉淀不再出现。
【分析】现象一中所说的经冰箱冷藏室贮存的(NH4)2SO4饱和溶液制成半饱和溶液沉淀蛋白质过程往往是等体积的(NH4)2SO4饱和液与等体积的蛋白质溶液混合后进行的。那么为什么会出现球蛋白沉淀一现即逝的现象呢? 经分析认为,这是冰箱温度较低,使(NH4)2SO4的溶液饱和度下降所致,瞬时出现的蛋白质沉淀只是在溶液混合的一刹那,在局部出现(NH4)2SO4盐的高浓度区域所致,而后盐被稀释后而溶解。于是我们把饱和的该盐溶液适当加热到常温下,使溶液中的结晶(NH4)2SO4溶解,这时再重复上述实验时,沉淀的球蛋白不再溶解。这种现象说明: 低温下的饱和(NH4)2SO4溶液和常温下的蛋白质溶液等量混合不形成半饱和的(NH4)2SO4溶液。只有常温下的饱和(NH4)2SO4溶液和常温下的蛋白质溶液等量混合,才可视为常温下的半饱和溶液。
2++
【现象二】用Cu和Ag沉淀蛋白质都属于重金属盐沉淀蛋白质的反应,它们都可与带负电荷的蛋白质结合后使蛋白质发生沉淀。因蛋白质是两性电解质,要使其带负电荷,它的环境
2++
必须呈碱性;而在酸性环境中蛋白质带正电荷是不能与Cu和Ag结合而发生沉淀的。但是在
2++
实验中,酸性条件下，蛋白质遇Cu不沉淀 ,这与实验原理是一致的,蛋白质遇Ag却常出现少量沉淀,多次重复亦然,与实验原理有所不符。
+
【分析】现象二中的Ag为什么在酸性条件下也会使蛋白质发生沉淀呢? 分析后认为:蛋白质是两性电解质,在酸性条件下表面上是带正电荷,但实际上只是在蛋白质分子中正电荷
+
的总量大于负电荷的总量而已,即电荷的代数和为正值,那么Ag同样可以和蛋白质分子的负
+
离子结合而使蛋白质沉淀的。我们还发现随着环境pH值的降低, Ag沉淀蛋白质的量也逐渐
2+
减少。这也从另一方面说明了分析的正确性。那么为什么Cu则不能使酸性条件下的蛋白质
2++
沉淀呢? 这可能与Cu的分子量小沉淀能力不及Ag大所致。
（二）利用蛋白质沉淀反应检验蛋白质的临床意义
正常人尿中只含微量蛋白质，不能用临床常规方法测定出来。用临床常规方法能检查出蛋白质的尿称为蛋白尿。患肾脏病的人(如患肾小球肾炎、肾盂肾炎)往往有蛋白尿，因而尿中蛋白质的检查在临床上具有重要的诊断意义。
【参考文献】
（1） 许秀珍，梁山.生物化学与分子生物学实验指导[M].广州：暨南大学出版社，
2003.11-15
（2） 赵晓唐，贾利霞，等.蛋白质沉淀反应中的两个特别现象的分析[J].邯郸医学高等专
科学校学报，2001，14（3）