拟胚体高密度培养促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

７８２　Ｔｉａｎｉｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１３，Ｖｏｌ　４１　Ｎｏ　８　实验研究　ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９￣．ｉｓｓｎ．０２５３—９８９６．２０１３．０８．０１２　拟胚体高密度培养促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化　陈明　毕琳琳　赵芳　王智泉　干学东　王扬淦　【摘要】　目的探讨拟胚体（ＥＢｓ）培养密度对小鼠胚胎干细胞（ＥＳＣｓ），ｔ￣，肌细胞分化的影响。方法小鼠ＥＳＣｓ　经过悬滴培养后形成ＥＢｓ后，以高、低密度（１２０、６０个ＥＢｓ／６０ｍｍ组织培养皿）贴壁培养，免疫荧光检测心肌特异性蛋　白肌钙蛋白Ｔ（ＴｎＴ）的表达。在不同时间点计算不同密度组搏动ＥＢｓ百分比；ＲＴ—ＰＣＲ检测Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、Ｂ～ＭＨＣ及　ＡＮＦ基因表达水平；Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测ＴｎＴ及ｐ３８表达水平。结果通过悬滴培养法形成的ＥＢｓ能够出现自发性搏　动并且有ＴｎＴ表达。高密度培养组与低密度培养组相比具有更高的搏动ＥＢｓ百分比，Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、１３一ＭＨＣ和　ＡＮＦ基因高表达水平，以及ＴｎＴ蛋白高表达水平（Ｐ＜０．０５）。高密度培养组的ｐ３８活性更高，使用ｐ３８特异性阻断剂　ＳＢ２０３５８０能够降低高密度组搏动ＥＢｓ百分比和ＴｎＴ蛋白表达水平。结论　ＥＢｓ贴壁培养密度是影响ＥＳＣｓ向心肌细　胞分化的一个重要因素，ＥＢｓ高密度培养相比于低密度培养能够获得更大程度的心肌分化，且该现象可能是由ｐ３８　信号通路所介导。　【关键词】胚胎干细胞；细胞计数；肌细胞，心脏；细胞分化；肌钙蛋白Ｔ；ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶类；拟胚体　Ｈｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｉｅｓ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃ；ｅｌｌｓ　ＣＨＥＮ　Ｍｉｎｇ　，ＢＩ　Ｌｉｎｌｉｎｚ，ＺＨＡＯ　Ｆａｎｇ￣，ＷＡＮＧ　Ｚｈｉｑｕａｎ　，ＧＡＮ　Ｘｕｅｄｏｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｙａｎｇｇａｎ　１Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｗｕｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７１，Ｃｈｉｎａ；　２　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｉｅｓ（ＥＢｓ）ｉｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｉｆ－　ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＥＳＣｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＥＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐｓ　ｆｏｒ　３　ｄａｙｓ，　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ａｎｏｔｈｅｒ　２　ｄａｙｓ　ｏｆｒ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｏ　ｏｆｒｍ　ＥＢｓ．Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　ＥＢｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ（６０　ｏｒ　１　２０　ＥＢｓ／６０　ｍｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈ）ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｏｎｔｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ　ｎＴ）ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕ－　ｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ．Ｔｈｅ　ｒｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ　ＥＢｓ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　ｓｐｅ—　ｃｉｉｆｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　Ｎｋｘ２．５．ＧＡＴＡ４　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　３－ＭＨＣ　ａｎｄ　ＡＮＦ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＴｎＴ　ａｎｄ　ｐ３８　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｂｅａｔｉｎｇ　ＥＢｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉ—　ｔｉｖｅｌｙ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴｎＴ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ　ＥＢｓ，ｈｉｇｈｅｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｎｋｘ２．５，　ＧＡＴＡ４，Ｂ—ＭＨＣ　ａｎｄ　ＡＮＦ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴｎＴ　ｉｎ　ｈｉ　ｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｕｌ—　ｔｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ　ｆＰ＜０．０５）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐ３８　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｃｕ￣ｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ　ＥＢｓ　ａｎｄ　ＴｎＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｐ３８　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＳＢ２０３５８０．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　ＥＢｓ　ｉｓ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＳＣｓ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｃｅｌｌ—ｄｅｎｓｉｔｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ＥＢｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＳＣｓ，ｗｈｉｃｈ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｐ３８　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔ；ｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｃａｒｄｉａｃ；ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ；ｐ３８　ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉ－　ｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ；ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｉｅｓ　胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＥＳＣｓ）具有多　养，其中悬滴培养是ＥＢｓ形成以及诱导心肌细胞分　向分化潜能，能够分化成外胚层、中胚层和内胚层３　化最常用的方法。但是通过悬滴法促心肌分化的程　个胚层的多种细胞，包括中胚层的心肌细胞。ＥＳＣｓ　度有限，因此观察影响悬滴法促心肌分化的因素并　源性的心肌细胞已经用于心肌梗死和病态窦房结综　通过优化培养方案提高心肌分化程度很有必要－ｚ　。　合征动物模型的移植ｎ　。体外通过形成拟胚体（ｅｍ．　国家自然科学基金资助项目（项目编号：８１２００１１９）；高　ｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｉｅｓ，ＥＢｓ）促进ＥＳＣｓ向心肌细胞分化。有３　校基本科研业务费专项资金（项目编号：１２１００７）　种方法可体外促使ＥＳＣｓ形成ＥＢｓ，分别是细菌培养　作者单位：１武汉大学中南医院心内科（邮编４３００７１）；２南方　皿中悬浮培养、甲基纤维素半固体培养以及悬滴培　医科大学神经生物学教研室　天津医药２０１３年８月第４１卷第８期　７８３　笔者既往研究表明，形成ＥＢｓ的起始ＥＳＣｓ数量以及　验方法参照说明书。ＧＡＰＤＨ作为内参，各基因ｍＲＮＡ相对　ＥＢｓ贴壁时间是影响心肌细胞分化的２个重要因素　。　本研究拟观察ＥＢｓ的贴壁培养密度对ＥＳＣｓ心肌细　胞分化的影响。　１材料与方法　１．１材料小鼠细胞系Ｅｌ４购自美国模式培养物集存库　表达水平用２－￣ｃ，法分析。　１．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测肌钙蛋白Ｔ（ｒｒｎＴ）及ｐ３８蛋白表达水　平在ＥＳＣｓ分化不同时间点用ＲＩＰＡ裂解液（５０　ｍｍｏＵＬＴｒｉｓ—　ＨＣＩ　ｐＨ７．４，１％ＮＰ４０，１５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，０．Ｉ％ＳＤＳ，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ）分别提取低密度培养组、高密度培养组及高密度培养＋　ＳＢ２０３５８０组的总蛋白。取２０　ｇ蛋白样品，使用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　电泳，分离的蛋白转至ＰＶＤＦ膜上。用５％脱脂奶粉封闭后，　加入兔抗Ｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ或者兔抗ｐ３８　ＭＡＰＫ４℃孵育过　夜。用ＴＢＳＴ洗膜后加入用ＨＲＰ标记二抗，室温孵育１　ｈ后洗　（ＡＴＣＣ）。ＥＳＣｓ培养基：高糖ＤＮ￣ＥＭ添加１５％胎牛血清（Ｇｉｂ—　ＣＯ），１　０００　Ｕ／ｍＬ小鼠白血病抑制因子（ＬＩＦ）购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公　司，１％双抗（Ｓｉｇｍａ），０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂ巯基乙醇、０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ非必　需氨基酸（Ｇｉｂｃｏ）。ＥＢ培养基：高糖ＤＭＥＭ添加２０％胎牛血　清，１％双抗，０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂ巯基乙醇，０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ非必需氨　基酸。　１．２　ＥＳＣｓ的培养ＥＳＣｓ复苏后按１×１０５个／ｍＬ接种于丝裂　霉素Ｃ处理的小鼠胚胎成纤维细胞（ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏ—　ｂｌａｓｔ，ＭＥＦ）饲养层上，ＥＳＣｓ培养基每１～２　ｄ换液１次，ＥＳＣｓ　每２～３　ｄ传代１次。　１．３　ＥＳＣｓ心肌分化取生长旺盛的ＥＳＣｓ，吸出ＥＳＣ培养　基，以０．２５％胰酶＋０．０４％ＥＤＴＡ消化液将ＥＳＣｓ消化成单个细　胞悬液，将细胞悬液按１　０００　ｄｒａｉｎ离心５　ｎｌｉｎ，弃上清。以ＥＢ　培养基重悬细胞，调整细胞浓度，使每２Ｏ　ｌ　细胞培养液中约　含１　０００个ＥＳＣｓ。在无菌细菌皿皿盖上接种２０　的细胞悬　液若干滴，悬滴完毕后将皿盖反扣于装有ＰＢＳ的细菌皿上。　开始做悬滴培养的天数计为分化第０天。悬滴培养３　ｄ后，收　集皿盖上悬滴培养形成的ＥＢｓ置于皿内做悬浮培养。悬浮　培养２　ｄ后，吸出ＥＢｓ置人铺有明胶的组织培养皿（６０ｍｍ）做　贴壁培养。高密度培养每皿置入１２０个ＥＢｓ，低密度培养每　孑Ｌ置人６０个ＥＢｓ。在不同的分化天数记录各组搏动ＥＢｓ的　百分比，每次至少计数５０个ＥＢｓ。分化第５天至第７天加人　ｐ３８特异性阻断剂ＳＢ２０３５８０，使其终浓度为１　ｔｘｍｏｌ／Ｌ。　１．４　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、Ｂ—ＭＨＣ和ＡＮＦ基　因表达在ＥＳＣｓ分化指定时间点，用ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取　总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为模板逆转录合成ｃＤＮＡ第一链。逆转录　产物进行ＰＣＲ反应，检测各种基因表达水平，各基因引物序　列见表Ｉ。ＰＣＲ反应使用ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔａｋａｒａ），实　Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　表１　ＲＴ—ＰＣＲ引物序列　基因　引物（５＇－－－，３　）　大小（ｂｐ）　Ｎｋｘ２．５　上游ＧｃＴＡＣＡＡＧＴＧｃＡＡＧＣＧＡｃＡＧ　下游ＧＧＧＴＡＧＧＣＧ　ｒＴＧＴＡＧＣＣＡＴＡ　ＧＡＴＡ４上游ＴＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡ　ＡＧＣ　下游ＧＴＧＧＣＡＴＴＧｃＴＧＧＡＧ＿ｒｒＡｃｃ　Ｂ—ＭＨＣ　上游ＴＧｃＡＡＡＧＧｃＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＡＧ　下游ＧＣＣＡＡｃＡＣｃＡＡｃｃＴＧＴｃｃＡＡＧ　ＡＮＦ　上游ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴ（；ＣｃＧＧＴＡＧＡ　下游ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴｃＴＴＣＧＴＡＧＧ　ＧＡＰＤＨ上游ＴＣＧＴＣＣＧＧＴＡＧＡＣＡＡＡ　ＡＴＧＧ　下游ＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴｃＧＴ　膜。加入增强化学发光（ＥＣＬ）反应液，暗室显影定影。采用　Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内参，以相对灰度值表示蛋白表达量。　１．６免疫荧光检测ＴｎＴ蛋白贴壁培养的ＥＢ，于分化第１２　天吸出ＥＢ培养液，用ＰＢＳ清洗３遍，加入４％的多聚甲醛固定　１５　ｒａｉｎ。ＰＢＳ清洗３遍，每次５　ｍｉｎ。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ破膜２０　ｍｉｎ，　Ｉ％ＢＳＡ封闭３０　ａｒｉｎ。３７℃下与兔抗Ｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ孵育　２　ｈ。ＰＢＳ清洗３遍，每次５　ａｒｉｎ。３７℃下与标记有Ｃｙ３的二抗　孵育１　ｈ。ＰＢＳ清洗３遍，每次５　ｍｉｎ，加入１　ｍｇ／Ｌ　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８常　眄育１０　ｍｉｎ。ＰＢＳ清洗３遍，每次５　ａｒｉｎ，荧光显微镜下观察。　１．７统计学方法应用ＳＰＳＳ　１３．０软件包对数据进行统计学　处理，实验结果以　＋ｊ表示，组间比较采用样本ｔ检验，　Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结果　２．１　ＥＳＣｓ的增殖和分化ＥＳＣｓ生长在ＭＥＦ饲养层　上呈鸟巢状集落样生长，细胞排列紧密，分界不清，　保持未分化状态，维持干性，见图１Ａ。去除ＭＥＦ饲　养层及ＬＩＦ后，ＥＳＣｓ经过３　ｄ的悬滴培养后，ＥＳＣｓ聚　积形成球形结构即ＥＢ，见图１Ｂ。再悬浮培养２　ｄ后　置人铺有明胶的组织培养板上，ＥＢｓ在２４　ｈ内贴壁　生长，贴壁的ＥＢｓ渐渐摊平，呈单层细胞生长，类似　荷包蛋，见图ｌｃ。部分贴壁培养的ＥＢｓ逐渐开始出　现自发性搏动，在分化第１２天，免疫荧光可以检查　到心肌特异性蛋白ＴｎＴ的表达，见图１Ｄ。　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色结果见图ｌＥ。　２．２高密度培养组与低密度培养组心肌分化程度　比较　２．２．１搏动ＥＢｓ百分比比较分化第７天，高密度　培养组开始有自发性搏动，但低密度培养组没有搏　动，其于分化第８天开始出现自发性搏动。２组搏动　ＥＢｓ百分比在分化第７～ｌ４天之间随时间增加而增　加，但是到分化第ｌ８天开始出现下降。在分化第８、　ｌ０、１２、１４、１８天，高密度培养组的搏动ＥＢｓ百分比高　于低密度培养组（尸＜０．０５），见图２。　２．２．２　Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ｐ—ＭＨＣ和ＡＮＦ基因表达比　较在分化第７天，高密度培养组的心肌特异性转　录因子Ｎｋｘ２．５和ＧＡＴＡ４基因表达水平高于低密度　７８４　Ｆｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ．Ａｕｇ　２０１　３，Ｖ‘　４１　一　一ｌ００　　８０　６０　４０　２０　０　窨ｓＨ　站　一低密度培养组　口高密度培养组　低密度培养组高密度培养组高密度培养　组＋ＳＢ２０３５８０　＿　＿■—◆　ＦｎＴ　分化天数（ｔ１）　与低密度培养组比较　，一０．０５，一Ｐ＜０．０Ｉ　Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｔｈｅ　ｐｅＪ’ｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｈｅａｔｉｎｇ　ＥＢｓ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ　Ｉ．０　。　。　２　同分化天数搏动ＥＢｓ百分比　组（尸＜０．０１），在分化第１４天，高密度培养组的心肌　特异蛋白３－ＭＨＣ和ＡＮＦ基因表达水平均高于低密　度组（Ｐ＜０．０１），见图３。　ｌ４　ｌ２　茬０　跚　苫０　ｏ－ｏ　低密度培养组高密度培养组高密度培养组＋　ＳＢ２０３５８０　螽１０　鬈ｓ　要　蚤　昌　４　“与低密度培养组比较Ｐ　Ｏ．０１；　与高密度培养组比　较Ｐ＜０．Ｏｌ　［ｉｇｕｒｅ　ｆ４　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＴｎＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　图４　Ｗｅｓｔｅｚ・Ｉ１一ｂｌｏｔ检测Ｔｎｑ、蛋白表达水平　高密度培养组低密度培养组　Ｎｋｘ２．５　ＧＡ　ＦＡ４　３１一ＭＨＣ　ＡＮＦ　一与低密度培养组比较Ｐ＜０．０ｌ　Ｆｉｇｕｒｅ　３　Ｃｏｍｐａｌ’ｉｓｏｎ（　Ｎｋｘ２．５．ＧＡｒｒＡ４．３－ＭＨＣ　ａｎ（１　ＡＮＦ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｌｅｖｅｌｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｇｒｔ）ｕｐｓ　罔３　２组Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、３－ＭＨＣ和ＡＮＦ基因表达水平比较　２．２．３　ＴｎＴ蛋白表达的比较分化第ｌ４天，高密度　培养组的ＴｎＴ蛋白表达水平高于低密度组（Ｐ＜　０．ｏ１）；高密度培养＋ＳＢ２０３５８０组的ＴｎＴ表达水低于　高密度培养组（Ｐ＜０．０１），　图４。　２．３高、低密度培养组ｐ３８活性比较在分化第８　天检测ｐ３８蛋白表达水平，结果高密度培养组相比　低密度培养组有更高的ｐ３８活性，见图５。分化第１０　及ｌ４天，高密度培养组使用ＳＢ２０３５８０后，搏动ＥＢｓ　百分比下降，见图６。　３讨论　１．Ｏ　０．８　＊　０．６　０．４　０．２　Ｏ．Ｏ　高密度培养组　低密度培养组　一与低密度培养组比较Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ　Ｆｉｇｕｒｅ　５　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐ３８　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　影响ＥＢ分化方向的冈素包括ＥＢ大小、可溶性　５　Ｗｅｓｔｅｌ＿Ｊ１一ｂｌｏｔ检测ｐ３８蛋白表达水平　　。笔者既往研究发现形成ＥＢ起　刺激因子、细胞外基质相互作用及细胞与细胞的黏　酸及维生素Ｃ等Ｉ　０００时，心肌分化程度高于起始数　附作用等。关于可溶性刺激　子的研究很多，促进　始ＥＳＣｓ数量为ｌＥＳＣｓ向心肌细胞分化的可溶性冈子包括一些生长　量为４００和４　０００时，并且ＥＢ贴壁时间过早（分化第　。本研究　因子如骨形成蛋白（ＢＭＰｓ）家族、Ｗｎｔ家族、成纤维　４天及之前）可以明显抑制ＥＳＣｓ心肌分化　１细胞生长因子（ＦＧＦｓ）家族，化学复合物ＤＭＳＯ、维甲　表明，ＥＢ贴壁培养密度也是影响ＥＢ心肌分化程度　一登　暑邕　鼙　天津医药２０１　３年８』｛第４１卷第８期　高衔度培养组　高密度培养组　＋ＳＢ２Ｏ３５８０　７８５　１ＯＯ　８０　６０　４０　２０　Ｏ　【夫ｌ子表达来ＥＳＣｓ心肌分化尚需进一步研究。　总之，ＥＢ培养密度是影响ＥＢ向心肌细胞分化　的一个重要的因素，高密度ＥＢ培养相比于低密度　ＥＢ培养能够获得更大程度的心肌分化，并且这个现　象与ｐ３８的活性有关系。　（图１　插贞）　分化天数（ｄ）　参考文献　【１　１　Ｍｕｒｒｙ　ＣＥ，Ｋｅｌｌｍ　Ｇ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂ！‘ｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｅｌｉｎｉ—　ｃａｌｌ３，ｒｅｌｅｖａｎｔ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ　ｆｒ（）ｒｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｌＪ】．　Ｃｅｌｌ，２００８，１　３２（４）：６６１—６８０．　ｈａｍａｎ　Ｋ．＿ｒａｋｉｎｇ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃ：　Ｉ２ｌ　Ｂｏｎｇｓｏ　Ａ，Ｆｏｎｇ　ＣＹ　Ｇａｕｔ“与高密度培养组比较Ｐ　０．０ｌ　Ｆｉｇｕｒｅ　６　ｂ］ｆｅｅｔｓ　ｏｆ　ＳＢ２０３５８０　Ｏ１３　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ　ＥｌＩ：ｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｕｈｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ　图６　ＳＢ２０３５８０对高密度培养组搏动ＥＢｓ百分比的影响　Ｍａｊｏｒ　ｅｈａｌｌｅｎｇｅｓ川．Ｊ（：ｅｌ　Ｉ　ｌ￣ｉａｅｈｅｍ，２００８．１　０５（６）：１　３５２—１　３６０．　的一个因素，高密度培养的心肌分化程度高于低密　度培养的心肌分化程度。　ＭＡＰＫｓ是真核细胞内的重要的信号转导酶，是　酪氨酸蛋白激酶体系的一个重要家族，参与细胞的　生长、增殖、分化。研究表明ｐ３８ＭＡＰＫ通路在哺乳　３　Ｃｈｅｎ　Ｍ，ｌ，ｉｎ　ＹＱ，Ｘｉｅ　ＳＩ　，ｅｔ　ａｌ　Ｅｎｒｉｅｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｉｆｅｒｅｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｌｏｎｓｅ　ｅｌｎｌ：）ｙｏｎｉｒｅ　ｓｔｅｍ　ｅｅｌｌｓ　ｂｙ　ｏｐｔｉ￣ｎｉｚｉｔＩｇ　ｔｈｅ　ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ　ｍｅｔｈ一　０（ＩＩＪ１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１　１．３３（４）：８５３—８５８．　４　Ｐａｒｋ　Ｊ，Ｃｈｏ　ＣＨ，Ｐａｒａｓｈｍ‘ａｍａ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｅｌ・ｏｆａｂｒｉ（　ａｔｉｏｎ—ｂａｓｅｄ　ｍ０ｄ—　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒ）ｒｏｎｉ（　ｓｔｅｎ１（，ｅｌｌ　ｄｉｆｔｉｗｅｎｔｉａｌｉｏｎ　】．Ｌａｂ　Ｃｈｉｐ，２００７，７　ｒ８１：ｌＯ１８—１０２８．　动物体节形成早期和肌节形成中发挥重要作用。通　过分析ｐ３８ＭＡＰＫ特异药物阻断剂和缺乏ｐ３８ａ基因　Ｂｏｈｅｌｅｒ　ＫＲ，Ｃｚｙｚ　Ｊ，Ｔｗｅｅ（１ｉｅ　Ｄ．ｅｌ　ａｌ，１）ｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｃａｒ（ｔｉｏｍｙｎ（’ｙｌｅｓ…．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ．２００２．９　１　（３）：１８９～２０１．　ＺＺ．Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　ｒｅｇｕｌａｒｉａｎ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　ｄｉｆ－　ｆ６　Ｊ　Ｃｈｅｎ　Ｋ．Ｗｕ　ｋ　Ｗａｎｇ　的ＥＳＣｓ分化能力，都可以发现ｐ３８ＭＡＰＫ参与ＥＳＣｓ　分化谱系选择　。笔者既往研究表明ｐ３８ＭＡＰＫ特异　阻断剂能够抑制ＥＳＣｓ向心肌细胞分化　。本研究发　现，高密度培养组的ｐ３８活性高于低密度培养组，使　ｆｅｒｅｎｔｉａｌ［ｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂＤ，ｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｅｅｌｌｓｌＪ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｅｈｅｍ，２００８，１０４　（１）：１　１９－１２８．　Ｄｕｒａｌ　Ｄ，Ｍａｌａｉｓｅ　Ｍ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ　Ｂ，ｅｌ　ａ１．Ａ　ｐ３８　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ａｌｌｏｗｓ　ｔ（）　ｄｉｓｓｏｅｉａｔｅ　ｄｉｆｍ＇ｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｔｉｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｕｐｏｎ　用ＳＢ２０３５８０能够降低高密度培养搏动ＥＢｓ百分比　及ＴｎＴ的蛋白表达水平。这些结果提示ｐ３８在ＥＳＣｓ　心肌分化过程中发挥重要的作用，不同密度培养的　ＥＢ心肌分化程度差异与ｐ３８的活性有关系。但是　关于高密度培养影响到哪些生长因子进而影响到　ｐ３８的活性，以及ｐ３８通过影响哪些转录因子及生长　Ｌｉｔ　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｉｎ　ｎ］ｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｅ　ｓｌｅｎ］ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ，　２００ｈ４．１１（３）：３３Ｉ－３４】．　【８】Ｃｈｅｎ　Ｍ，Ｌｉｎ　ＹＱ，Ｘｉｅ　ＳＩ｜．ｅｔ　ａ１．Ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ—　１—’ｉｎｄｕｅｅｄ　ｃａｒｄｉａｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｅｈｅｍ，２０１０，１　１　１ｆ６１：１６１９—１６２８．　（２０１３一Ｏ１—２５收稿２０１３—０３—２５修回）　（本文编辑闰娟）　国内外研究快讯　ＶＥＧＦ调节足细胞上的ＴＲＰＣ６离子通道　ｍ浆巾ｍ管内皮细胞生长凶子（ＶＥＧＦ）浓度的升高　以及足细胞　瞬时受体电位阳离子通道蛋白６（ＴＲＰＣ６）　合成的阻滞剂，环己酰亚胺存在时，没有观察到ＶＥＧＦ　对ＴＲＰＣ６蛋白表达水平的促进作川，这表明ＶＥＧＦ对　ＴＲＰＣ６的这种作Ｈ】需要从蛋白合成外始。ＶＥＧＦ１６５显　著增加了足细胞【ｆ】　ｒＲＰＣ６媒介的钙内流。使用ＲＮＡ于　的过度表达郜和肾脏疾病的蛋白尿有关，因此，本实验　重点研究ｒ　ＶＥＧＦ是　能调节足细胞上ＴＲＰＣ６的表　达。研究使用ＶＥＧＦＩ６５处理培养的足细胞，分别川定　量ＲＴ—ＰＣＲ逆转录一聚合酶链反应和免疫印迹法来分析　ＴＲＰＣ６　ｍＲＮＡ和蛋白的表达。共聚焦娃微镜分析用黄　色荧）匕蛋ｎ标记的足细胞上的　ＦＲＰＣ６。ＴＲＰＣ６相火的　扰技术敲除ＴＲＰＣ６基因后，足细胞巾的钙内流显著降　低。免疫组化结果显爪：和对照组相比．糖尿病肾病患　者足细胞上的ＴＲＰＣ６通道蛋白和２型ＶＥＧＦ受体蛋白　（ＶＥＧＦＲ一２）都有所增加。存人的肾皮质中ＶＥＧＦＲ一２　ｍＲＮＡ和　ＦＲＰＣ６　ｍＲＮＡ　著千【Ｉ火ｆｎ＝４８；ｆ＝０．５８５；Ｐ＜　０．０ｏｕ。研究结果提爪ＶＥＧＦ可以足细胞上的　ＦＲＰＣ６。　钙离子内流』ｆＪ荧光定量的方法来分析。糖尿病肾痫组　和对照组肾脏组织免疫荧光和免疫组化分析结果表明，　使用ＶＥＧＦｌ６５处理培养的足细胞后能够显著增力ＩＩ　ＴＲＰＣ６　ｍＲＮＡ的表达和蛋白水平，并且ＶＥＧＦ１６５的这　种作用具有剂量依赖性，而且，磷酸次黄苷酸３一激酶抑　制剂能够阻断ＶＥＧＦ的这种作用。当一种蛋门质生物　（刘晔摘２７：９２ｌ－９２９）　杨卓审校译自Ｎｅｐｈｒｏｌ　Ｄｉａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１２，　双重免疫组化技术检测胃低分化腺癌误诊为淋巴瘤一例　（正丈见７６２页　卜、ｉｇｔＩＩ　１　Ｔｈ（－ｌ　。Ｉ‘　ａｐｈ　’ｈｉｉ　ｔ－ｔ“ｇａｓｈ　。　ｌｒｄｉａ（　ｎｅｏｐｌａｓｌｌ／（ａ：ｌｉｅ×４０：ｈ：…ｃ×１Ｏ０）　Ｊ冬『１　Ｉ　ｆ　ｆＩ’ｊｆ｝＝　ｆ　物）匕镜『ｇｌ“ｌ：ＩｔＥ×４０：ｈ：ＨＥ×１００１　肿瘤细胞ＣＥＡ阳件‘　棕色　问质淋巴细胞１　（：Ａ阳，ｒ　Ｉ　Ｄ：．】　包　ｉｏｈｉｓｌｏ￣。ｈｅｌｎｉｓｉｌ’ｙ　ｆｉｇｕｒ￣、ｓ　ｏｌ　ｇａｓＩＩ’ｉｃ　ｃａｒｄｉａｃ　ｌ１Ｐ０１）Ｉａｓ『Ｉ１（ｒｌ（　ｕｈＪＰ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｘ　１００　２　胃　门邮ｌ】１】物免嫂　化　色　（双　×１００）　拟胚体高密度培养促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化　（正文见７８２页　Ｉ　｝｛Ｉ　Ｉ　　＋　’｛　Ａ　｝一　…Ｂ　Ｕ　Ｉ　Ｆｉｇｍｅ　Ｉ　Ｆｈｉ　ｍｏｒｐｈｏｌ　Ｉｌｆ　ＥＳＣｓ　ａｎｄ　ＥＢｓ　图ｌ　ＥＳＣｓ和Ｅｌｌｓ形态　，ｆ／