1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株
抗生素产生菌：链霉菌 效价测试菌：白色念珠菌 1.1.2 培养基
（1）斜面培养基（%）：高氏1 号培养基 （2）种子培养基（%）：葡萄糖1.5，酵母粉1.0，K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05， FeSO4 0.001，CaCO3 0.04，pH6.5。 （3）发酵培养基（%）：黄豆粉0.6，可溶性淀粉 3.0，酵母粉1.0，K2HPO4 0.1，NaCl 0.2，MgSO4 0.002, FeSO4 0.002, pH6.5 （4）白色念珠菌培养基（﹪）：葡萄糖2.0，蛋白胨1.0，琼脂2.0，pH 自然 1.1.3 标准样品
制霉菌素（效价6038 u·mg-1） 1.1.4 树脂
（1）阳离子树脂：Dowex 50×16, Dowex 50×8（Dow Co.）； 001×7, D113, D115
（2）大孔吸附树脂：SP207（三菱）， XAD7HP（罗门哈斯）， NKA, NKA-9, X-5 1.2 实验方法
1.2.1 发酵液的制备
菌种30℃斜面培养5 d；取2 环活化的菌种，接入装有50 mL 培养基的250 mL 三角瓶中，30℃ 160 r·min-1 培养24 h 作为种子液； 种子液按10%（v/v）的接种量接入到5 L 通气搅拌发酵罐中，转速200 r·min-1, 28℃下培养48 h。 1.2.2 发酵液预处理
发酵液下罐后，4800 rpm 离心10 min，取上清液；离心后的发酵液用草酸调节pH 4，加入0.12%的壳聚糖絮凝剂，放置1h 后4800 rpm 离心10 min，收集上清液。絮凝效果采用透光率和回收率两个指标进行评价。具体如下：
（1）透光率测定：以水为空白对照，在610 nm 下，测定絮凝后清夜的透光率，衡量菌体去除率。
(2) 回收率：管蝶法测定效价，絮凝后清夜效价/直接离心后（4800 rpm 离心10 min）的发酵液效价。 1.2.3 萃取实验
取40 mL 预处理过的发酵液，分别用盐酸、氢氧化钠溶液调pH 为2~9, 再将溶液一分为二，分别加入等体积的氯仿、石油醚，静置过夜，分别测水相和有机相的抑菌活性。
1.2.4 离子交换层析 1）静态交换实验
树脂的筛选：称取0.5 g 待筛选干树脂和10 ml 萃取浓缩液（折算成制霉菌素为1.76mg·mL-1）于150 mL 锥形瓶中，置于摇床中，100 r·min-1, 20 ℃恒温振荡5 h 后测交换残液抑菌活性。倾出残液后，各加入0.6 mol·mL-1 氨水
溶液10 mL,，置于摇床中5 min（条件同3上），调pH 到中性，测解析液的抑菌活性。
2）动态交换实验
流速的选择：分别以1.5 BV·h-1、2 BV·h-1和4 BV·h-1流速在离子交换柱(Φ1.5×3.4cm )上对该抗生素进行吸附，通过穿透曲线选择合适的流速。洗脱剂的选择：分别以1 mol·L-1 NaCl, 1 mol·L-1 NH4Cl 和0.6 mol·L-1 NH3水为洗脱剂[3]。萃取浓缩液上柱(Φ1.5×3.4cm )后，分别用上述洗脱液洗脱，洗脱流速为1 BV·h-1，检测波长为280 nm。 1.2.5 大孔吸附层析 1）树脂的筛选
取0.5 g 干树脂和30 ml 经离子交换后的收集液于150 mL 三角瓶中，100 r·min-1,20℃下恒温振荡5 h 后测吸附残液抑菌活性。倾出残液，加入20 mL 乙醇, 置于摇床振荡5 min（条件同上），测解析液的抑菌活性。 2）抗生素的洗脱
经离子交换后的收集液以1.5 BV·h-1 的流速上柱，用去离子水以2 BV·h-1 洗脱至数值恒定；然后分别用不同浓度的乙醇溶液以1 BV·h-1 洗脱，洗脱液减压浓缩后，HPLC 检测纯度并测抑菌活性。 1.3 分析方法
1.3.1 管碟法测抑菌活性 1.3.2 活性物质的HPLC 测定
高效液相色谱仪为Waters 2690, 色谱柱为YMC-Pack CN 4.6×250mm×5μm 氰基柱，流动相为pH=4 的0.1 mol·L-1 乙酸铵缓冲液，流速为0.8 mL·min-1，检测波长为270 nm，进样量为8 uL。 2. 结果与讨论
2.1 壳聚糖絮凝剂处理
由于微生物细胞表面有大量羧基和磷酸基等阴性基团，使细胞呈负电性，有机高分子絮凝剂壳聚糖利用本身良好的水溶性、所带电荷及亲水基团，中和菌体表面电荷破环水化膜，以其不分支链状结构架桥直接用于絮凝微生物细胞。由表2.1 可知，处理后的发酵液的透光率有很大提高，回收率为99.25﹪，说明壳聚糖絮凝剂对发酵液进行处理有较好的效果。
2.2 pH 梯度下氯仿和石油醚的萃取实验
pH 梯度下氯仿和石油醚对该抗生素的萃取结果如表2.2 所示。由表2.2 可知，该抗生素为水溶性物质，在酸性和中性条件下稳定。随着pH 值升高接近中性后，该抗生素能溶于氯仿中，但不能溶于石油醚中；在碱性条件下该抗生素不稳定，抗菌能力下降。
有机溶剂萃取可以除去发酵液中色素和很多极性杂质，而采用有机相的洗涤也可除去小极性杂质和色素。根据表2.2 的结果本工作采用氯仿4 次萃取发酵液，收集有机相, 减压蒸干后，用pH 2 的去离子水溶解，再用石油醚3 次洗脱，收集水相。实验中用1500 mL 发酵液，收集了500 mL 的萃取液，用管碟法测得发酵上清液经萃取后效价由3160 u·mg-1 提高到8885 u·mg-1，收率为93.7%, 且除去了大部分色素。
2.3 离子交换层析
2.3.1 离子交换树脂的筛选
采用静态吸附试验方法，以树脂对该抗生素的绝对吸附量为筛选指标，并参照解析率进行筛选。结果如表2.3 所示。
表2.3 静态树脂筛选结果
由表2.3 可知，强酸型阳离子交换树脂对该抗生素的吸附能力较弱酸型阳离子交换树脂强。一般来说，强酸性树脂与H+结合力弱，相应的与抗生素的交换能力也强，在氨基酸和氨基糖苷类抗生素的分离中应用较多。
Dowex50×16 的静态吸附能力比Dowex50×8 要高，这可能是由于前者的交联度大。树脂的交联度越大，则孔径越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到，但提高了交换的选择性；另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强度高。当然，如果交联度过大则对水的膨胀性差，不利于外界离子进入树脂内部与骨架上同电性离子发生交换，交换反应的速度慢。Dowex50×16 和001×7 的静态吸附能力相当，但前者的解析率较后者高。因此，在本研究中选取Dowex50×16。 2.3.2 离子交换柱层析
通过分析穿透曲线选择上样流速为2 BV·h-1, 洗脱液为0.6 mol·L-1 NH3 水、洗脱速度为1 BV·h-1 的洗脱效果最适。洗脱曲线如下：
由图2.1 可知，经萃取后的活性物质浓缩物经Dowex50×16 阳离子交换树脂柱层析后，有2 个洗脱峰。峰1 的峰高比较低且峰比较宽，重复实验（不同批次的发酵液）发现，峰1的峰形很不稳定，可能含有多种物质；而峰2 在重复实验中比较稳定，峰高与峰宽比大。抑菌实验表明，两个洗脱峰均有抑菌活性，但是峰1 收集液的抑菌活性远较峰2 收集液低。在本研究中对峰２洗脱液进一步采用大孔吸附树脂纯化。
表2.4 离子交换洗脱液的抑菌实验分析
2.4 大孔吸附层析
2.4.1 大孔吸附树脂的筛选
采用静态吸附试验方法，以树脂对该抗生素的绝对吸附量为筛选指标，并参照解吸率进行筛选。结果如表2.5 所示。
由表2.5 可知，极性树脂XAD7HP,NKA-9 的吸附量明显高于其它几种非极性树脂。XAD7HP的吸附量略高于NKA-9,这可能是由于前者具有较高的比表面积，使得吸附容量略有增大。
2.4.2 大孔吸附柱层析的洗脱曲线
经吸附后的大孔树脂，分别用不同浓度的乙醇水溶液洗脱，测定抑菌活性（如表2.6所示）。由表可知，10%的乙醇水溶液几乎洗不下活性物质；随着乙醇浓度的增加，洗脱液中的活性物质增加；70%和90%乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱液中的抑菌活性相差不大，且前者略高于后者。据此，在本实验中采用阶跃洗脱，先用10%的乙醇水溶液洗脱除杂，再用70%的乙醇水溶液洗脱并收集（如图2.2）。 表2.6 不同酒精浓度下洗脱液的抑菌实验分析
由图2.2 可以看出，洗脱曲线共有2 个峰，分别由10%，70%乙醇溶液洗脱得到。对这两个峰的收集液进行抑菌活性试验可知：峰1 为杂质峰，无抑菌效果；而峰2 的抑菌效果较明显（结果如表2.7）