黄芪多糖对免疫功能影响的体外实验研究

医药２０１４年　且第３６卷第１８期Ｈｅｂｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａ１．２０１４．Ｖｏ１　３６　Ｓｅｐ　Ｎｏ．１８　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—７３８６．２０１４．１８．００３　・论著・　黄芪多糖对免疫功能影响的体外实验研究　刘印华　李树义赵志强　张庆波　【摘要】　目的探讨黄芪多糖对小鼠免疫功能的影响，为黄芪多糖的临床应用提供理论依据。方法取小鼠脾　细胞，置于９６孔细胞培养板中，设黄芪多糖组和空白对照组，ＷＳＴ．１法测细胞的增殖活性；ＥＬＩＳＡ测细胞因子ＩＬ一２、　ＩＦＮ・　；流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞表型。结果黄芪多糖组细胞增殖活性显著高于空白对照组（Ｐ＜０．Ｏ１）；黄芪多　糖组ＩＬ－２、ＩＦＮ一　的浓度随黄芪多糖浓度的增加而增多，在一定浓度范围内呈剂量依赖关系；黄芪多糖既能刺激Ｂ淋　巴细胞增殖，也能刺激Ｔ淋巴细增殖。结论黄芪多糖可增强免疫功能，它不仅能提高体液免疫功能，而且能提高细　胞免疫功能。　【关键词】　黄芪多糖；体液免疫；细胞免疫；干扰素；白细胞介素＿２　【中图分类号】　Ｒ　９１７　【文献标识码】　Ａ　【文章编号】　１００２—７３８６（２０１４）１８—２７３１—０３　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｏｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＬＩＵ　Ｙｉｎｈｕａ　，ＬＩ　Ｓｈｕｙｉ，　ＺＨＡＯ　Ｚｈｉｑｉａｎｇ，ｅｔ　ａ１．　Ｈｅｂｅｉ　Ｎａｎｐｕ　Ｓａｈｅｒｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｅｂｅｉ，Ｔａｎｇｓｈａｎ　０６３３０５，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｅ，ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌｓ。ｗｈｉｃｈ　ｐｌａｃｅｄ　ｉｎ　９６一ｗｅｌｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅｓ．　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＷＳＴ一１　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｈｉｌｅ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｒ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＬ－２，ＩＦＮ一　；ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜　０．Ｏ１）；ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＬ一２　ａｎｄ　ＩＦＮ一　ｉｎ　ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｉｓｉｎｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ａ　ｄｏｓｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ　ｉｎ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｒａｎｇｅ；ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｃａｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｃａｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｔ　ｃａｎ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｈｕｍｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｃａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　ａｓｔｒａｇａｌｉｎ　ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅｓ；ｈｕｍｏｒｌａ　ｉｍｍｕｎｅ；ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｅ；ＩＦＮ一＾ｙ；ＩＬ－２　黄芪桂枝五物汤载于《金匮要略・血痹虚劳病脉　１．１材料黄芪多糖：由河北联合大学药学院提供。　证治》，该方由黄芪、芍药、桂枝、生姜、大枣五味药组　测增殖用试剂ｗｓＴ－１：购于江苏碧云天生物科技公司。　成，具益气温经、和营通脉之功…。原方主要是治疗　１．２实验用动物取４—６周龄昆明种小鼠，体重（２０　血痹，而现代临床应用已远远超越了原方“血痹”症的　±２）ｇ，雌雄各半，ＳＰＦ级，购自北京军事医学科学院。　范畴，尤其是在治疗类风湿性关节炎、微循环障碍和脑　（合格证编号：０１２３８８３）　中风后遗症等方面，收到满意的疗效＿２　Ｊ。长期以来备　１．３小鼠脾细胞增殖活性的测定取５周龄小鼠４　受中医学者青睐，是临床常用经典名方之一。黄芪是　只，雌雄各２只，颈椎脱臼处死，无菌分别取脾脏，细胞　黄芪桂枝五物汤中的主要成分之一，黄芪多糖具有多　筛研磨成脾淋巴细胞悬液，加入１　ｍｌ蒸馏水破碎红细　种重要的生物学作用，包括对免疫功能的影响，但黄芪　胞，３０　Ｓ后加入１．８％氯化钠溶液，ＰＢＳ洗细胞３次，计　多糖对机体免疫功能影响的系统研究，经河北省医学　数细胞数，调细胞浓度为１．０×１０　／ｍｌ。在９６孑Ｌ细胞　情报研究所查新（编号：１３０１０５２０１３０６１８）目前在国内　培养板中，每孔加１００　Ｉｘｌ细胞悬液，１Ｏ　ｌ不同浓度的　外尚未见文献报道。本项目将通过小鼠脾细胞体外实　黄芪多糖溶液（０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０　ｍｇ／ｍ１），同时　验，系统研究黄芪多糖对免疫功能的影响，为临床应用　设不加黄芪多糖的对照组。每组设３个复孔，置ＣＯ，　和相关产品的开发提供实验依据。　培养箱中分别培养３、６、９　ｄ，用ＷＳＴ．１测ＯＤ值，４只　１材料与方法　小鼠取均值。　１．４小鼠ＩＬ一２，ＩＦＮ一＾ｙ的测定　上述细胞测定增殖　项目来源：唐山市科学技术研究与发展计划（编号：１３１３０２５３ｚ）　作者单位：０６３３０５　河北省唐山市，河北省南堡盐场医院（刘印　前，取上清５０　ｌ置于一８０℃冰箱中保存备用。样品　华）；河北联合大学（李树义、赵志强、张庆波）　收集完毕后，分别检测ＩＦＮ－　ＩＬ－２的含量（按酶联免　通讯作者：张庆波，０６３００９河北省唐山市，河北联合大学；　疫试剂盒说明书的要求操作）。　Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｑｂ１９５５＠１６３．ｃｏｒｎ　１．５细胞亚群分析检测小鼠脾细胞中ＣＤ３＋细胞和　可北医药２０１４年８月第３６卷第１８期Ｈｅｂｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４，Ｖｏｌ　３６　Ｓｅｐ　－１　ＣＤ１９细胞。取小鼠脾淋巴细胞悬液，以５×１０。／ｍｌ的　浓度接种于２４孔培养板中，每孔１．５　ｍｌ，实验组加入　２．０　ｍｇ／ｍｌ的黄芪多糖溶液０．５　ｍｌ，对照组加入０．５　ｍ１　用，其最佳浓度为２　ｍｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５或＜０．０１）。见　表１。　表１　黄芪多糖对小鼠免疫细胞增殖活性的影响　±ｓ　ＲＰＭＩ一１６４０培养液，培养６　ｄ后，取细胞悬液，　１５００转／ｍｉｎ，离心５　ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤；加入ＦＩＴＣ进行免　疫标记反应（１００　ｔｘｌ细胞悬液：１００　ｌ抗体），避光孵　育３０　ｍｉｎ；ＰＢＳ洗２次，每管加入２００　Ｉｘｌ　１％多聚甲醛　固定，流式细胞仪检测。　１．６统计学分析应用ＳＡＳ软件，计量资料以元±ｓ　注：与对照组比较，　Ｐ＜０．０５，　＜Ｏ　０１　表示，采用重复测量方差分析，计数资料比较采用ｘ　检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结果　２．２细胞上清ＩＦＮ．＾ｙ的测定ＥＬＩＳＡ检测结果显示：　黄芪多糖组ＩＦＮ．　的含量显著高于对照组（Ｐ＜０．０５　或＜０．０１）。培养３、６和９　ｄ，的黄芪多糖组以　２．０　ｍｇ／ｍｌ浓度最高，高于此浓度时，其含量不再增加。　见表２　ｎ＝４，ｐｇ／ｍ］，　±ｓ　２．１黄芪多糖对小鼠免疫细胞增殖活性的影响　实　验结果显示黄芪多糖对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作　表２　ＩＦＮ一　的测定　注：与对照组ｔｔ较，　Ｐ＜０．０５，　Ｐ＜０　Ｏ１　２．３　ＩＬ一２的测定黄芪多糖组ＩＬ－２的含量随着黄芪　显（Ｐ＜０．０５或＜Ｏ．０１）。见表３。　ｎ＝４，ｐｇ／ｍ１．　±　多糖浓度的增加而升高，以２．０　ｍｇ／ｍｌ浓度效果最明　表３　ＩＬ－２的测定　注：与对照组比较，　Ｐ＜０．０５，　＜０．０１　２．４细胞亚群分析对照组ＣＤ３细胞为５．１２％，黄　病变微循环障碍的患者；赵桂华等　运用黄芪桂枝五　物汤对小鼠的免疫调节作用进行了研究；许利平等。。　对黄芪桂枝五物汤加味的药效作用研究证实该方有一　定程度的镇痛、抗氧化作用；黄兆胜等　对黄芪桂枝　芪多糖组ＣＤ；细胞为９．４１％；对照组ＣＤ，９细胞为　２．７３％，黄芪多糖组ＣＤ，９细胞为４．５９％。２组比较，　差异均有统计学意义（Ｐ＜０．叭）。见表４、５。　表４　ＣＤ３亚群的检测　五物汤及其配伍抗炎镇痛的比较研究将该方按药对研　究法拆方分组；施旭光等　进行了黄芪桂枝五物汤及　其配伍对佐剂性关节炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究；　许晓峰　等证实黄芪桂枝五物汤有抑制佐剂性关节　炎大鼠血清中ＩＬ一１　Ｂ、ＴＮＦ—Ｏｔ升高的作用。　对复方中各单味药化学成分及药理作用研究，如：　黄芪中含有的黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物具有较强　的生物活性，黄芪皂苷主要作用于心脑血管，通过扩张　３讨论　血管达到降压目的；黄芪多糖主要作用于多种免疫活　性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生　成　…。桂枝的有效成分是挥发油，主要为桂皮醛和桂　皮酸，可扩张血管，促进发汗、解热、镇痛、镇静、利　尿　。芍药中的主要有效成分为芍药总苷，现被广泛　黄芪桂枝五物汤的药理学研究主要集中在饮片层　次，从整体效果及拆方后药物的配伍组合，如：王妮　等　进行了黄芪桂枝五物汤加减，治疗血液高粘滞综　合征；马丽　用黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经　塑　匡荭　Ｑ　生　筮　鲞筮１８期Ｈｅｂｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｍａｌ。２０１４。Ｖ。１　３６　ＳｅＤ　Ｎｏ．１８　２７３３　用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病¨　。大枣　中含有多种有效成分，如大枣多糖、黄酮类、皂苷类、三　萜类、生物碱类等。大枣多糖是大枣中重要的活性物　２赵蕊，蒋明．黄芪桂枝五物汤的临床应用．黑龙江中医药，２００７，４：６０．　６２．　质，有促进淋巴细胞增殖作用，可提高机体免疫力。大　枣中的黄酮类物质对脑缺血所致的脑组织超微结构损　３王妮，方瑜，袁有财，等．黄芪桂枝五物汤加减治疗血液高粘滞综合　征．陕西中医学院学报，２００７，３０：１９－２０．　４马丽．黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变微循环障碍的影响．　辽宁中医杂志，２００６。３３：１４０—１４１．　５赵桂华，唐其风．黄芪桂枝五物汤对小鼠的免疫调节作用．中国冶金　工业医学杂志，２００６，２３：７０８－７０９．　６许利平，胡晓梅，任桂华，等．黄芪桂枝五物汤加味的药效学研究．四　伤有保护作用。大枣中所含的皂苷类物质，具有调节　人体代谢、增强免疫力、抗炎、抗变态反应、降血糖和胆　固醇等作用¨　巧Ｊ。　黄芪是黄芪桂枝五物汤中的主要有效成分之一，　川生理科学杂志。１９９９，２１：３０．　７黄兆胜，施旭光，朱伟，等．黄芪桂枝五物汤及其配伍抗炎镇痛的比　较研究．中药新药与Ｉ临床药理，２００５。１６：９３－９６．　８施旭光，朱伟，黄兆胜，等．黄芪桂枝五物汤及其配伍对佐剂性关节　研究结果表明：黄芪多糖能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，　炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究．中药新药与临床药理，２００６，２２：３．　促进细胞因子的分泌。在一定浓度范围内，随着黄芪　５．　多糖浓度的增加，细胞增殖效果也随之增加。ＩＬ－２和　９许晓峰，林斌，王沛坚．黄茂桂枝五物汤对ＡＡ大鼠血清ＩＬ一１８、ＴＮＦ．　ｑ的影响．现代生物医学进展，２００７。７：１２０２．１２０４．　ＩＦＮ一　的分泌量亦如此，具有明显的量效关系。相关　１０卢彦琦．黄芪化学成分及药理作用综述．保定师范专科学校学报，　研究显示多糖对Ｂ细胞有促进增殖的效果＿１　，但对Ｔ　２００４，１７：４０－４２．　１Ｉ刘江云．桂枝的化学成分研究．中草药，２００２，３３：６８１－６８３．　细胞的作用则取决于多糖种类＿】　，本实验在检测细胞　１２郑辉．白芍总苷的抗风湿药理作用．浙江中西医结合杂志，２００８．　亚群时发现Ｔ、Ｂ细胞均有大幅增长，表明黄芪多糖对　１８：５２０．　１３苗明三，孙丽敏．大枣的现代研究．河南中医，２００３，２３：５９－６０　机体的细胞免疫、体液免疫均有显著的增强作用。　１４周运峰．大枣多糖抗氧化作用．中西医结合，１９９７，（特刊）：９７－９８．　黄芪多糖的研究较多，但缺乏对其进行系统深入　１５崔振环．复方大枣合剂对小鼠乳腺癌生长抑制作用的初步观察．天　的研究，本项目将对其进行系统深入研究，包括体外研　津医科大学学报，１９９９，５：１５．１６．　１６杨晓林，孙菊云，张沦．褐藻糖胶的有丝原效应．中华微生物学　究和体内研究，可望对黄芪的作用有全面了解，以便在　和免疫学杂志，１９９１，１　１：２８２－２８４．　临床得到更好的应用。　１７庄茂辛，吴耀生，李曼玲．黄芪、党参、人参多糖对豚鼠免疫功能的　影响．中国药学杂志，１９９２，２７：６５３－６５５．　参考文献　（收稿１３期：２０１４—０３—２８）　１黄仰模主编．金匮要略讲义．第１版．北京：人民卫生出版社，２００３．　７１＿７２　・　肖　息・　摘要及关键词应符合本刊要求　摘要必须包括目的、方法、结果、结论４个部分，并标引２—５个关键词。　１．中文摘要２５０个字左右，英文摘要４００个实词左右。　２．采用第三人称撰写。　３．结果部分在进行描述性陈述的同时，如有必要还可给出主要的数据。　４．英文摘要题录部分应包括文题（仅第一个单词首写字母大写）、所有作者的姓名（汉语拼音，姓每个字母均大写，名字仅首字　母大写）、第一作者工作单位名称；所在城市名、邮政编码及国名。　５．关键词标引请尽量使用美国国立医学图书馆编辑的最新版《Ｉｎｄｅｘ　Ｍｅｄｉｃｕｓ＞＞中医学主题词表（ＭｅＳＨ）内所列的词，可通过　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｍｅｓｈ查询。如其中尚无相应的词，则可根据树状结构袁选用最直接的上位　词，必要时采用惯用的自由词并排列于最后，各词间用“；”分隔。　本刊编辑部