生物催化

摘要：在食品工业中，广泛使用海藻糖（α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡萄糖苷），因为它对冷冻和脱水有保护作用。海藻糖类似物额外的好处就是他们不被消化，因此不利于我们对热量摄入。当它被用于反向合成模式时，这种的海藻糖类似物可以用海藻糖磷酸酶制造而得。但是，一种经济有效的净化过程仍然缺乏。因此，要研究海藻糖在活性炭上的吸附能力，并与在这个过程中的主要污染物半乳糖醇进行了对比。海藻糖的吸附能力被认为是显着高于半乳的，表明海藻糖类似物可以从生物转化的混合物中除去。用含水乙醇的选择性解吸允许回收产品的纯度超过97％。在吸附/解吸附过程之前，通过离子交换工序，使产量从24％增至31％，但也增加了价格。因此，为了纯化的酶产生海藻糖类似物，把活性碳的使用作为新战略。

关键词：海藻糖类似物，活性炭，吸附，解吸

1. 前言

海藻糖（α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡萄糖苷）是一种存在广泛的非还原性二糖（最显着存在酵母和植物中），它能预防环境压力如热，冻结和干旱[1]。它在很宽的pH值范围内也是稳定的，有一种温和的甜味，未致龋。这些特性使得它非常适合用于加工食品的准备[2]，其合成类似物乳海藻糖（α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃半乳糖苷）具有额外的好处，它不能由肠道海藻糖酶水解，因此，不利于我们对热量的摄入[3]。此外，因为众所周知用于刺激人体肠道双歧杆菌生长的半乳糖残基的存在，乳海藻糖是一个潜在的益生素[4]。

嗜热厌氧细菌的海藻糖磷酸酶（EC2.4.1.）的使用[5]，描述了乳海藻糖的生物催化生产。作者提出了一个耦合的反应，它开始来自廉价基板海藻糖和半乳糖，而不是昂贵的中间产物β-D-葡萄糖-1 - 磷酸（βGlc1P，图1）。对于下游的处理，（生物）化学处理和色谱分离步骤联合实施。然而，色谱带来了一个相当高的运营成本，禁止了大规模使用海藻糖类似物。其他净化程序，仍然需要进行评估。

无机吸附通常用来去除颜色，气味和生物过程的污染物[6-10]。依据经济和可持续发展的标准，粒状或粉状活性炭已被认为是广泛应用的最好的吸附剂[8,11-17]。最近，活性炭已被选择性地用于纯化含有其他的麦芽寡糖，如麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖水溶液的麦芽[18]。麦芽是由于吸附容量低于其他麦芽寡糖，其纯度在几个吸附循环后，可提高至75％[19]。然而，要获得高纯度的寡糖，吸附本身通常是不够的，需要结合解吸，其解吸要用不同比例的水/乙醇作为洗脱液。 [20]例如，单糖和双糖首先可以用浓度为5-15％乙醇进行回收，接着具有较

高聚合度（DP）的低聚糖可以用浓度为30-50％乙醇进行回收。

在本研究中，海藻糖类似物使用了活性炭使用的生物转化混合物，它的纯化已被评估。为此，作为模型化合物的海藻糖的吸附特性，第一次被检查，并与那些半乳糖醇（这个过程中的主要污染物）进行了对比。吸附 - 解吸促进了酶促反应中乳海藻糖的高效净化。 2. 实验

2.1. 材料和化学品

用酸洗过的团聚煤为主的粒状活性炭CPG-LF12×40（性能见表1），是一种礼物Chemviron 3种碳（USA）。它是用热去离子水（60-70°C之间）预处理2 h，然后70℃左右，置于干燥器干燥过夜。海藻糖，半乳糖醇和其他试剂均购自Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA)。 2.2. 平衡实验？

在一个250ml的玻璃烧瓶中，取任一海藻糖（40mM）或半乳糖醇（25mM）100毫升，与1-40％（m/ v）的预处理活性炭混合。烧瓶303 K的培养箱（Multitron，Switzerland）中，以200rpm振摇5h。样品通过0.22ml尼龙针头式过滤器过滤，然后才通过HPLC分析。方程(1)计算了CPG-LF复合吸附的量。其中qe为每克吸附剂的吸附量（mmol/g），V是该溶液的体积（升），M是吸附剂的重量（克），Co和Ce的分别是初始溶液和平衡浓度（毫摩尔/升）。 2.3. 动力学实验？

250毫升的玻璃烧瓶中，10克预处理活性炭，用50ml去离子水混合。将悬浮液加热至30℃，并用一个磁电路搅拌器（VMS-C7，VWR）以200rpm下搅拌。随后，加入50ml的预热吸附质溶液，以获得所需的初始浓度。在不同的时间收集样品，并通过HPLC分析。由于取样是小于2.5％，溶液体积的整体减少，这意味着在接近恒定的液体体积，测定吸附速率。方程（2）计算了吸附夸脱qt（毫摩尔/克）的量。其中，Ct是在时间t的液相浓度。 2.4 乳海藻糖的生产

从Caldanaerobacter subterraneus [21]的海藻糖磷酸酶生产乳海藻糖，使用500mM的海藻糖和pH7.0，37℃，30mM磷酸缓冲液的半乳糖作为基板。加入干面包酵母至最终浓度为25g / L时，通过除去多余的葡萄糖达到产率的最大化。以这种方式，10天后乳海藻糖浓度可以达到200mM。接着，将产物纯化分为三个简单步骤。首先，在37℃下，通过大肠杆菌海藻糖酶处理，将剩余的海藻糖降解

为葡萄糖。接下来，在30℃下，再加入面包酵母消耗单糖，葡萄糖和半乳糖。最后，将溶液稀释5倍，并进一步纯化，如下所述。 2.5 吸附 - 解吸分离纯化

在303 K和200rpm下5h，将生物转化的溶液（200毫升）与10％的活性炭混合。然后，通过一个塞茨滤波器（Werke GmbH, Germany）将碳真空过滤，并转移到一个玻璃柱中（77×3厘米）。用0-15％（v/v）的乙醇进行洗脱，以纯的形式，含有所需的碳水化合物的馏分被汇集，并在50℃下，使用旋转蒸发器过滤并浓缩。 2.6。通过离子交换色谱法分离纯化

在室温下，将生物转化的溶液（200毫升）加载到一个玻璃柱里（77×3厘米），其里面为平等床体积的1X8离子交换树脂（醋酸盐的形式，化学有限公司，德国）(acetate form, Alfa Aesar, Germany)。用2个柱床体积的去离子水洗涤树脂，并收集小部分进行分析。因为树脂是在一个完全解离的状态下，所以每个周期后，3个柱床体积的乙酸钾（1 M）树脂的再生是必要的。 2.7 分析步骤

通过配备一个Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm, BIO-RAD)的HPLC高效液相色谱(Varian Prostar)和RI检测器(Varian Prostar model 350)，测定乳海藻糖，海藻糖和其他污染物。5mM硫酸，65°C下进行洗脱。 3. 结果与讨论 3.1 吸附等温线

通过表面上的吸附量（量子效率）和液相中溶质浓度（Ce）之间的关系，常常可以描述吸附行为，它可以由相应的等温线说明。对于稀的水溶液，如生物催化转化的混合物，则优先使用Langmuir方程（3）和Freundlich方程（4）。其中QL和KL分别是有关最大单层的吸附容量和能量的Langmuir吸附平衡常数；KF和N是有关吸附容量和吸附强度的Freundlich常数。在理想情况下，基于同质表面的单分子层吸附，Langmuir方程最初源于活性炭的气 - 固相吸附。反过来，在一个中间压力范围内，由异构表面上的吸附过程，提出了Freundlich方程 [22]。 在这项工作中，活性炭上的海藻糖和半乳糖醇吸附，已嵌合到两个方程中，为未来预测以找到最准确的（图2）等温线。有人发现，在这两种情况下（R2> 0.98）的实验数据，Freundlich方程对应最好。这也表明，海藻糖的KF值高于2.7倍的半乳糖（表2），其中单糖和双糖的典型模式是一致[12,19]。这些结果表明，它应该有可能纯化海藻糖或及其类似物之一，其中类似物来自于含有主要污染物半乳糖

醇的生物转化混合物。事实上，已经发现，当其他组分存在于混合物中时，分子的吸附行为是不改变 [6]。此外，虽然这些低数字似乎表明活性炭CPG-LF的表面是有点异质性的（表2），但是海藻糖和半乳糖醇的N值是有利于吸附。 3.2 活性炭的不均匀性

CPG-LF活性炭表面的不均匀性的证据已经分布研究得到了。更具体地说，海藻糖的固 - 液分配系数KD是从下面的方程计算出的：KD=CS/CW。Cs是吸附剂在固体颗粒中的浓度，Cw是吸附剂在水溶液中的浓度。（图3）我们发现使海藻糖的浓度以及pH值和温度保持恒定，随着活性炭量的增加，KD值发生变化。这说明CPG-LF的表面是不均匀的，因为在均匀的表面和固定PH条件下，KD值不会随海藻糖的量的变化而变化。此外发现，较高的吸附剂量使qe值降低，这可由表面不均匀模型来解释。在低剂量下，所有的吸附位点暴露，表面吸附作用较快，因此qe值较高。相反，在较高剂量下，由于一部分低能量位点？被占用，使高能量位点的可利用性降低，造成qe值较低。 3.3吸附动力学

在应用中，能够在给定条件下预测吸附作用以什么速率进行是十分重要的。为此，提出了多种动力学模型，从准一级吸附模型、准二级吸附模型到孔道扩散模型。在这些模型里，准二级速率表达式已被广泛用于水溶液中吸附基底，用于吸附的吸附剂有活性炭和粘土等。速率大小可用方程表示：

式中

qe是每克吸附剂的吸附量，k是准二级速率常数。该模型的优点是在不知道任何参数的情况下，可以从方程中确定初始吸附率。从上述公式中计算出的乳海藻糖和半乳糖醇的吸附量与实验结果一致（表3）。因此，看起来能够准确描述乳海藻糖和半乳糖醇与CPG-LF的吸附作用（图4），还说明了吸附过程除物理吸附外，还有化学吸附。

为了鉴定影响吸附过程的动力学机制，使用了颗粒内扩散模型。用方程表示为：

公式中kpi是浓度i下的颗粒内扩散速率常数，Ci是截

距，大小与边界层厚度的有关。qt-t1/2作图应该是一条kp为斜率、C为截距的直线。然而，我们模型的结果是多线性的，说明过程是分两步进行的（图5）。首先，比较倾斜部分是因为外部表面吸附，而第二阶段可以描述为逐渐吸附，该阶段粒子内部扩散成为因素。对于海藻糖和半乳糖醇，kp1高于kp2，而C1低于C2（表4）。大体类似的是，开始时吸附作用较快是因为活性炭有可用的自由表面。当吸附了碳水化合物形成厚层时，吸附能力降低，并受被吸附物从碳粒子

外部到内部的运输速率控制。事实上，线不经过原点，表明颗粒内扩散只是吸附过程中速率控制的一个步骤。可能还有其他一些吸附机制，如离子交换、沉淀或其他物理现象。

3.4 生物转化混合物的纯化

以海藻糖和半乳糖为底物，海藻糖磷酸化酶为生物催化剂生产乳海藻糖（图1）。然后用海藻糖酶和面包酵母处理产品混合物以除去多余的碳水化合物。这个过程是非常便宜和有效的，但是产生了多种低浓度的发酵产品，如半乳糖醇、甘油、乳酸和醋酸。以上这些产物需要用其它的纯化技术除去，最常用的有离子交换色谱法和活性炭吸附。虽然使用活性炭后，离子交换可以降低装载负担，但是该技术相当昂贵。因此，通过纯的乳海藻糖复苏的两种方法比较，活性炭先于或后于阴离子交换。

经预处理的生物转化的混合物中，含有40mM乳海藻糖和25mM半乳糖醇，首先用1X8离子交换树脂装载上，并用离子交换水洗涤。从逻辑上说，不带电的糖类和醇没有固定到基质上，而带负电(糖基)磷酸脂和乳酸被保留(图6)。含有树脂的乙酸乙酯作为抗衡离子，然后用活性炭混合穿流，并振摇5 h以达到吸附平衡。乳海藻糖，半乳糖醇，甘油的吸附量分别被认为是76， 35和19％。这表明乳海藻糖与活性炭结合是最优选的化合物，在吸附过程中半乳糖醇是主要污染物。然而，选择性吸附剂允许用含水乙醇作为洗脱剂，甚至可以进一步净化乳海藻糖。事实上，单糖和双糖的分离可以用乙醇梯度，通过洗脱逐渐去除结合牢固的成分[20]。以我们的情况看，大部分的半乳糖醇和甘油已经用水洗涤除去，而用10％或更高浓度的乙醇洗脱乳海藻糖（图7）。在这种方式中，乳海藻糖被回收的回收率为31 ％，纯度在97％以上。

作为一种替代方法，评价预处理的生物转化混合物的乳海藻糖，使其直接纯化，而省略了离子交换色谱法。在吸附步骤中，观察到了前面的过程中类似的模式，乳海藻糖>半乳糖醇>甘油>乙酸>乳酸>磷酸的顺序有约束力的偏好。同样地，用10-15％乙醇选择地吸附乳海藻糖导致了24％的产率和超过97 ％的纯度（图8）。在这一步骤程序中，起始混合物中离子的积存量也许可以说明，乳海藻糖的产量有所下降。尽管如此，从商业的角度来看，产品是有高纯度的，省略了代价高的色谱法是有利的。 4. 结论

运用活性炭CPG- LF 12 40的实验测定海藻糖和半乳糖的吸附平衡和动力

学。认为其吸附能力是海藻糖比半乳糖醇高，可以通过Freundlich方程可以准确地描述。反过来，吸附动力学可以通过伪二阶模型成功地模拟，同时粒子内部扩散成为速率控制步骤之一。

这些因素允许从含有主要污染物半乳糖醇的生物转化混合物中，把乳海藻糖纯化出来。然而，以获得高度的纯品，用乙醇/水的梯度发现，在活性炭中选择性吸附剂是必不可少的。前面叙述的吸附/解吸过程，通过离子交换工序，产率从24％提高到31％，但也增加了价格。因此，为纯化海藻糖磷酸酶产生的新二糖，直接使用活性炭是优选的。