pH对生物反应器发酵生产粪链球菌的影响

王红波;陈禅友;刘洁;童佩;李硕

【摘 要】pH是影响生物反应器高效发酵生产粪链球菌的关键因素，粪链球菌生长的适宜pH范围为6.3～7.5。本试验对粪链球菌的发酵过程进行了pH与非的比较研究。结果表明：pH非，发酵10 h，发酵液pH下降至4.67，菌体生长受到抑制；发酵14 h，发酵液中活菌数达到4.4×109 cfu/mL。 pH，间歇流加NaOH溶液，维持发酵液pH 6.3～7.8，能提高菌体细胞耗氧量，增加蔗糖的分解代谢速率，解除菌体生长抑制，延长菌体的对数生长期；发酵16 h，活菌数达到7.3×109 cfu/mL，较非提高了65.9%。%The pH of fermentation broth was a key factor in the efficient production of Streptococcus faecalis in bioreactor.The optimum pH range for

Streptococcus faecalis was 6.3~7.5.Regulation and non regulation of pH were stud-ied comparatively in fermentation processes.When the pH of broth was not regulated,the pH dropped to 4.67 after 10 h, the growth of Streptococcus faecalis was inhibited,and the colony-forming units reached to 4.4×109 cfu/mL in the fermen-tation broth after 14 h.When the sodium hydroxide solution was added intermittently,the pH of broth was regulated,the pH was maintained between 6.3 and 7.8,the rate of oxygen consumption of Streptococcus faecalis was increased,the catabolism rate of sucrose was increased,the inhibition of cell growth was released,the logarithmic phase of cells was pro-longed.The colony-forming units reached to 7.3×109 cfu/mL after 16 h,which was increased by 65.9%.

【期刊名称】《中国饲料》 【年(卷),期】2015(000)014 【总页数】4页(P14-16,21)

【关键词】粪链球菌;pH;发酵;;生物反应器 【作 者】王红波;陈禅友;刘洁;童佩;李硕

【作者单位】江汉大学生命科学学院，湖北省豆类 蔬菜 植物工程技术研究中心，湖北武汉 430056;江汉大学生命科学学院，湖北省豆类 蔬菜 植物工程技术研究中心，湖北武汉 430056;武汉回盛生物科技有限公司，湖北省兽药工程技术研究中心，湖北武汉430042;武汉回盛生物科技有限公司，湖北省兽药工程技术研究中心，湖北武汉430042;武汉回盛生物科技有限公司，湖北省兽药工程技术研究中心，湖北武汉430042 【正文语种】中 文 【中图分类】S816.3

粪链球菌（Streptococcus faecalis）也称粪肠球菌，为乳酸菌中的一类，属于链球菌科，肠球菌属，细胞呈球形，兼性厌氧，是革兰氏阳性菌（Franz等，2011）。粪链球菌作为益生菌，在动物的生产中应用效果良好，可提高动物机体的抗体水平，强化巨噬细胞的活力，提高免疫能力，促进动物健康养殖（Liu 等，2014；Swain 等，2009）。 在水产养殖中，粪链球菌有利于提高饲料的利用率，降低饲养成本，改善饲养环境。粪链球菌为兼性厌氧的乳酸菌，需氧量低，降低水体富营养的能力强，改善水质的功效良好。目前用摇瓶发酵优化粪链球菌培养条件

的研究报道较多，但用生物反应器高效制备粪链球菌的发酵研究报道较少，摇瓶培养与生物反应器培养差异大，产业化大规模低成本发酵生产的难度大。溶氧和pH是发酵的两个关键因素，粪链球菌耗氧量低，溶氧易控制。因此试验研究了用生物反应器发酵生产粪链球菌的pH策略，为大规模高效发酵生产粪链球菌提供理论参考。 1 材料与方法

1.1 菌种 粪链球菌，由江汉大学生命科学学院保藏和提供。

1.2 培养基 固体培养基：葡萄糖2.5%、酵母浸粉1.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、柠檬酸氢二铵0.2%、乙酸钠0.4%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、琼脂粉2.0%，pH值7.0。

种子培养基：蔗糖2.5%、酵母浸粉2.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸氢二钠0.1%、柠檬酸氢二铵0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.005%、吐温-80 0.1%、碳酸钙0.8%，初始pH值8.0，121℃灭菌30 min。

发酵培养基：蔗糖3.0%、酵母浸粉1.5%、牛肉膏1.5%、蛋白胨1.0%、乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸氢二钠0.1%、柠檬酸氢二铵0.3%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.005%、吐温-80 0.1%、乳化硅油0.2%、碳酸钙0.8%，初始pH值8.0，121℃灭菌30 min。

以上三种培养基组成均在Liu等（2014）和莫海燕等（2013）的研究基础上经过进一步发酵优化研究而得出。 1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化 将保存于甘的菌种稀释后涂布于培养皿固体培养基，37℃恒温培养48 h。

1.3.2 种子液制备 用3 mL无菌水从培养皿固体培养基上洗下菌落，取1 mL菌液

接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，37℃、150 r/min培养15 h，获得种子液。

1.3.3 生物反应器发酵培养 按6%的接种量将种子液接入装有6 L发酵培养基的10 L发酵罐中，37℃，通气量0.4 VVM，搅拌转速200～300 r/min，流加5 mol/L NaOH溶液对发酵液的pH进行。 1.3.4 pH测定 使用pH电极测定。

1.3.5 发酵液中蔗糖浓度测定 取1 mL发酵液8000 r/min离心15 min，取上清液测定蔗糖的浓度，检测3个平行样品。蔗糖含量测定参考李利军等（2003）的紫外分光光度法。

1.3.6 活菌量 将发酵液按 106、107、1083个梯度进行稀释，取0.1 mL稀释后的发酵液涂布于培养皿固体培养基，每梯度重复3个培养皿，37℃培养 48 h，计数活菌数（cfu/mL）。 2 结果与讨论

2.1 pH对粪链球菌生长的影响 粪链球菌在不同的恒定pH环境（5.7～7.8）下发酵17 h，对比发酵液中粪链球菌的活菌数。研究结果表明，pH为6.6最有利于粪链球菌的生长。Liu等（2014）运用响应面优化的方法优化得出粪链球菌发酵液最佳的pH为6.7。pH低于6.0时，菌体生长受到抑制，生物量降低。6.3～7.5是菌体合适的pH范围，菌体生长良好，发酵液活菌数较高。pH为7.8时发酵液中活菌数降低，但降幅较小（图1）。发酵前期需要流加NaOH溶液中和粪链球菌生成的乳酸，而乳酸钠为强碱弱酸盐，水解后显碱性，为了控制恒定的发酵液pH，发酵后期需流加酸性溶液中和碱性。由于粪链球菌在pH 6.3～7.8生长差异不明显，为了操作简便、成本低廉、环境友好，只需发酵液的pH在6.3～7.8即可。

图1 pH对粪链球菌生长的影响

2.2 pH与非对发酵液pH及NaOH溶液残留量的影响 粪链球菌在pH非的自然条件下发酵生长，发酵前10 h，乳酸快速合成，pH下降明显；发酵10 h后，发酵液pH下降至4.67，发酵液pH趋于稳定。配制5 mol/L的NaOH溶液200 mL，中和发酵液中粪链球菌生成的乳酸，发酵液的pH为6.3～7.8。粪链球菌在pH的条件下发酵生长，当发酵液pH低于6.3时，流加NaOH溶液，控制pH为6.3～7.8。发酵1 h后开始流加NaOH溶液中和乳酸，发酵9 h后停止添加，发酵前5 h流加速率逐渐增加，发酵后4 h流加速率逐渐降低，表明菌体乳酸的合成能力在发酵4 h后达到最大值。发酵9～20 h，发酵液pH从6.49上升至8.33，此过程无需发酵液的pH。发酵液pH的升高可能是因为在发酵后期，粪链球菌的乳酸合成能力逐渐下降，新合成的乳酸少，且乳酸钠水解显碱性使发酵液的pH升高。粪链球菌生产只需在发酵前期（前9 h）流加NaOH溶液，使发酵液的pH维持在6.3～7.8，菌体生长良好（图2a、b）。 图2 pH与非对发酵液pH（a）及NaOH溶液残留量（b）的影响 2.3 pH与非对发酵液溶氧的影响及搅拌转速的变化规律 溶氧（DO）与通气量、搅拌转速和菌体耗氧能力密切相关。在通气量和搅拌转速恒定的情况下，溶氧水平能反映粪链球菌的耗氧能力。pH非，发酵前6 h，搅拌转速恒定于200 r/min，发酵液溶氧从83%下降到54.3%。为了使碳酸钙与乳酸充分混合，中和乳酸，发酵6 h后搅拌转速缓慢提升至250 r/min，溶解氧逐步上升至

79.7%；发酵7～10 h过程中，溶氧缓慢下降；发酵10～20 h时，溶氧缓慢上升，菌体耗氧能力下降。pH发酵生产粪链球菌，发酵前3 h，转速恒定于200 r/min，发酵前3 h发酵液溶氧从85.7%快速下降至20.9%；发酵3 h后，搅拌转速缓慢提升至250 r/min，发酵7 h后，搅拌转速缓慢提高至300 r/min。发酵10 h后，发酵液的溶解氧开始缓慢上升，表明菌体耗氧能力下降，菌体生长速率下降。研究结果表明，控制发酵液的pH为6.3～7.8，能降低发酵液的溶氧，增加

菌体的耗氧量，有利于菌体生长（图 3a、b）。

2.4 pH控制与非对蔗糖代谢的影响 Rea和Cogan（2003）研究表明，培养基中葡萄糖和果糖能抑制粪链球菌对柠檬酸盐的代谢，而蔗糖和半乳糖对柠檬酸盐的代谢无抑制作用。同时蔗糖相对于葡萄糖为缓释碳源，能降低乳酸的合成速率，有利于粪链球菌的生长。因此，本研究用蔗糖取代葡萄糖，作为发酵生产粪链球菌的碳源。发酵过程pH非时，发酵前16 h，蔗糖的平均代谢速率为1.23 g/L·h。发酵前12 h蔗糖的代谢速率快，主要满足于菌体的生长；发酵12 h后蔗糖代谢速率开始降低，主要满足于菌体自身生存的需要。发酵过程pH时，发酵前16 h，蔗糖的平均代谢速率为1.48 g/L·h，菌体生长快速；发酵16 h后，蔗糖分解速率开始降低，菌体生长进入稳定期，能量需求下降（图4a）。 图3 pH与非对发酵液溶氧的影响（a）及搅拌转速的变化规律（b） 图4 pH与非对蔗糖代谢（a）及发酵液活菌数（b）的影响

2.5 pH与非对发酵液活菌数的影响pH是菌体生长的关键因素，不发酵液的pH，随着pH的降低，菌体细胞的耗氧能力下降，蔗糖代谢的能力下降，发酵10 h，pH降至4.67，菌体生长受到抑制。发酵14 h后菌体生长进入稳定期，发酵液中活菌数为4.4×109cfu/mL。莫海燕等（2013）研究表明，粪链球菌达到稳定期的时间为18～20 h。发酵液的pH维持在6.3～7.8，能提高菌体细胞的活力，增加菌体的蔗糖代谢能力和耗氧能力，提高了菌体的生长速率，延长了菌体的对数生长期，发酵16 h后，菌体生长进入稳定期，发酵液的活菌数达到7.3×109cfu/mL（图4b）。可见，发酵液的pH，发酵液的活菌数提高了65.9%。 3 结论

本试验结果表明，pH低于4.67时，粪链球菌生长受到抑制，进入衰老期。发酵1～9 h，流加NaOH溶液，发酵液的pH于区间为6.3～7.8，能增加发酵液

中粪链球菌活菌数，较非提高65.9%。采用该pH方法发酵生产粪链球菌，效果良好、成本低廉、操作简单、重复性好。 参考文献

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