白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇甲氧丙二酰ACP生物合成基因ozmF的遗传分析

第２６卷第１期　２００８年２月　上海交通火学学报（农业科学版）　Ｖｏ１．２６　Ｎｏ．１　：Ｆｅｂ．２００８　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＨ＇ＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）　文章编号：１６７１－９９６４（２００８）０１－００１７—０３　白色链霉菌ＪＡ３４５　３中垩唑霉素生物合成基因簇　甲氧丙二酰ＡＣＰ生物合成基因　ｏ　ｚｍＦ的遗传分析　赵春华　，宋丹凤　，周秀芬　，沈　奔　，邓子新・　（１．上海交通大学教育部代谢工程重点实验室，上海２０００３０；２．威斯康星大学Ｍａｄｉｓｏｎ分校化学系，美国）　摘要：恶唑霉素（ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ，ＯＺＭ）是由白色链霉菌ＪＡ３４５３产生的杂合聚酮聚肽抗生素，其结构特征为螺旋链接的ｐ一内酯～一　内酰胺，垩唑环，（Ｅ，Ｅ）二烯和（ｚ，ｚ，Ｅ）三烯链。恶唑霉素具有抗肿瘤，抗病毒和一定的抗细菌的生物活性。前面＿Ｔ－作中我们已经从白　色链霉菌ＪＡ３４５３中定位了１３５　ｋｂ的ＤＮＡ区域，这个区域覆盖了整个ｏｚｍ基因簇，对部分片段测序揭示了负责甲氧丙二酰ＡＣＰ　生物合成位点的６个基因。本文通过突变以及互补分析其中的甲基转移酶基因ｏｚｍＦ并证实其与恶唑霉素生物合成相关。这些结　论有助于我们通过组合生物化学的方法产生新的ＯＺＭ衍生物。　关键词：杂合聚酮聚肽；恶唑霉素；甲氧丙二酰ＡＣＰ生物合成位点　中图分类号：Ｑ９３９．９３　文献标识码：Ａ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　ｏｚｍＦ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｘｙｍａｌｏｎｙｌ－ＡＣＰ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｌｏｃｕｓ　ｏｆ　ＯＺＭ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｉｎ　Ｓ．ａ／ｂ　ＪＡ３４５３　ＺＨＡ　０　Ｃｈｕｎ－ｈｕａＩ，ＳＯＮＧ　Ｄａｎ－Ｊｂｎｇ｜，ＺＨＯＵ　Ｘｉｕ－ｆｅｎＩ，ＳＨＥＮ　Ｂｅｎ２，ＤＥＮＧ　Ｚｉ－ｘｉｎｌ　（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｈｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＲＣ　ａｎｄ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３０，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ（ＯＺＭ），ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍ），　ｃｅ￥　６　ＪＡ３４５３，ｉｓ　ａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ—ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－　ｉｚｅｄ　ｂｙ　ａ　ｕｎｉｑｕｅ　ｓｐｉｒｏ—ｌｉｎｋｅｄ　１３－１ａｃｔｏｎｅ／＇ｙ—ｌａｃｔａｍ　ｍｏｉｅｔｙ，ａｎ　ｏｘａｚｏｌｅ　ｒｉｎｇ，ａｎ（Ｅ，　一ｄｉｅｎｅ，ａｎｄ　ａ●　互　一ｔｒｉｅｎｅ　ｃｈａｉｎ．ＯＺＭ　ｅｘｈｉｂｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉｖｉｒａｌ，ａｎｄ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｉｎ　ｐｒｅｖｉｏｕｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｅ　ｈａｖｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ａ　１３５　ｋｂ　ＤＮＡ　ｒｅｇｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｓ．ａ／ｂｕｓ　ＪＡ３４５３　ｃｏｖｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｔｉｒｅ　ＯＺＭ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｃ　ｃｌｕｓｔｅｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｓｉｘ　ｇｅｎｅｓ　ｌｉｋｅｌｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｍｅ山ｏｘｙｍａｌｏｎｙｌ—ＡＣＰ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌａｔｔｅｒ　ｉｎ　ＯＺＭ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｎ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｂｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ－　ｔａｌＴ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ，ｏｚｍＦ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｍｅｌｈｙｌｌｒａｎｓｆｅ：ａｓｏ：７＂，ｈｉｎ　ｔｈｉｓ　ｌｏｃｕｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｈａｖｅ　ｎＯＷ　ｓｅｔ　ｔｈｅ　ｓｔａｇｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ＯＺＭ　ａｎａｌｏｇｓ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｍｅｔ｝－ｏｄｓ　ｉｎ二　５　．　Ｋｅｙ　ｗｏｒ￣：ｈｙｂｒｉｄ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ—ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ；ｃｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ；ｎｌｃ．Ｊｌｏｘｙｎｌ　。：：，ｌ—ＡＣＰ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｌｏｃ　ＬｌＳ　在２０世纪后半叶，天然产物构成了现代医药工　业新药研发的中心支柱，在１９８１年到２００２年之　４９％的用于临床的新化合物来源于天然产物＿１１。聚酮　垩唑霉素（ＯＺＭ）是由白色链霉菌ＪＡ３４５３产生的，其　结构特征为螺旋链接的ｐ一内醣一一内酰胺，垩唑环，　：Ｅ，Ｅ）二烯和一个（ｚ，ｚ，Ｅ）三烯链嘲。通过同位素标记　的前体喂养实验，已经初步了解ＯＺＭ的生物合成。　ＯＺＭ的碳链骨架来源于３分子甘氨酸和９分子乙　酸，而全部５个碳甲－基１个氧甲基和１个氮甲基基　团来源于甲硫氨酸，但是Ｃ。一Ｃ　单位，Ｃ　。和Ｃ　，的来　源还不清楚旧．　图１）。　和聚肽［３１组成了天然药物的两个重要家族．它们以多　酶复合体的形式按照严格的装配线模型进行合成。合　成步骤的单体为有机酸或氨基酸。聚酮合酶（ＰＫＳ）和　非核糖体肽合成酶（ＮＲＰＳ）模块聚在～起能够合成杂　合聚酮聚肽（ＰＫＳ—ＮＲＰＳ）化合物［４１。　收稿日期：２００７—０９—１９　作：彗简介：赵春华（１９７９一），博士生，研究方广ｕｊ：抗生素分子　・　ｕａ　学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘＩｌａｃｃｈｕ．、ｕ．ｅｄ　ｎ．　通讯作者简介：邓子新（１９５６一），男，湖北人，　｛　ｌ　科学院陇１　（授，本刊编委，研究．　：放线菌遗传学和抗生素生物合成，先后共主持３Ｃ余项　国家级和国际合ｆＦ项Ｆｊ，己在国内外学本刊物工发袭ＩＣ９余筒　文．　一　ｌａｉ！：ｚｘｄｅｎｇ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ＣＩＩ．　维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ８　上海交通大学学报（农业科学版）　第２６卷　Ｈ３　Ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ（ＲＩ＝Ｒ２＝Ｈ）　Ｔｒｌｅｄｌｍｙｃｌｎ　Ａ（ＲＩ＝ＣＨ３，Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣＨ３）　图１　恶唑霉素（ＯＺＭ）分子的化学结构　Ｆｉｇ．１　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ（ＯＺＭ）　虽然同位素标记的前体喂养实验没有确定Ｃ３一　ｃＣ延伸９Ｏ　ｓ），ＰＣＲ产物通过Ｒｏｃｈｅ基因回收试剂盒　Ｃ４的起源，但相似的化学结构在其他几个天然产物　回收。　中已经被发现，如ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ３，ＦＫ５２０，ｇｅｌ—　１．４　ＯＺＭ分离提纯　ｄａｎａｍｙｃｉｎ，ｓｏｒａｐｈｅｎ以及ｔａｕｔｏｍｙｃｉｎ，称为甲氧丙二酰　收取在ＭＳ培养基上培养５　ｄ的菌丝体（大约ｌＯ　ＡＣＰ延伸单位［７１。甲氧丙二酰ＡＣＰ生物合成的基因已　个２０　ｍＬ固体平板培养基量）并用乙酸乙酯萃取２　经被鉴定出来，所涉及的５个基因毫无例外的与聚酮　次，经过大孔树脂分离纯化后用Ｐｒｏｄｉｇｙ　ＯＤＳ之柱　合酶的基因连锁。这些结果暗示ＯＺＭ的Ｃ　一Ｃ　结构　ＨＰＬＣ分析［５１。分离条件为：流速１　ｍＬ・ｍｉｎ一，６０％到　也来源于甲氧丙二酰ＡＣＰｔＳｌ。　９Ｏ％甲醇梯度洗脱２０　ｍｉｎ。美国Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ—Ｍａｄｉｓｏｎ　前期工作中我们（ｉ）发展了白色链霉菌ＪＡ３４５３　仪器分析中心提供ＨＰＬＣ和质谱数据。　有效的遗传系统，能够在体内对ＯＺＭ生物合成基因　进行分子生物学操作。（ｉｉ）通过ＰＣＲ的方法从白色链　２结果与分析　霉菌ＪＡ３４５３中克隆了甲氧丙二酰ＡＣＰ合成基因，然　后定位了整个ＯＺＭ合成基因簇［９１。本文报道了甲氧丙　基因ｏｚｍＢＣＤＥＦＧ可能是ＯＺＭ基因簇中负责甲　二酰ＡＣＰ生物合成基因ｏｚｍＦ的失活和互补并确定　氧丙二酰ＡＣＰ合成的操纵元…１。为了证明克隆的甲氧　ｏｚｍＦ为ＯＺＭ生物合成基因簇的一部分。　丙二酰ＡＣＰ合成基因是ＯＺＭ生物合成所必须的，首　先通过靶向ＲＥＤＩＲＥＣＴ的基因置换方法将ｏｚｍＦ敲　１实验材料与方法　除。为了避免敲除ｏｚｍＦ对下游基因的极性效应影响，　所以采用了同框缺失的策略　通过对基因ｏｚｍＦ在　１．１菌株与质粒　ＮＣＢＩ的生物信息学分析，发现ｏｚｍＦ是一个氧甲基化　菌株白色链霉菌ＪＡ３４５３由德国Ｈａｎｓ　Ｋｎｏｅｌｌ研　酶，与来自其他天然产物ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ３，ＦＫ５２０，ｇｅｌ—　究所的Ｗｅｒｎｅｒ　Ｆ．Ｆｌｅｃｋ赠与，ＲＥＤＩＲＥＣＴ系统（包括　ｄａｎａｍｙｃｉｎ负责甲氧丙二酰ＡＣＰ合成的氧甲基化基　入一ＲＥＤ和ＦＬＰ重组系统）由英国Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ研究所提　因Ａｓｍｌ７，ＦｋｂＧ，ＧｄｍＧ高度同源［８１。我们采用了英国　供【ｌ０１。　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ研究所提供ＲＥＤＩＲＥＣＴ系统（包括入一ＲＥＤ　１．２培养基　和ＦＬＰ重组系统）来构建ｏｚｍＦ的同框缺失突变株【ｌｏｌ。　ＬＡ用于培养大肠杆菌，ＴＳＢ用于培养链霉菌　首先．含有ｏｚｍＦ的６４２１　ｂｐ的ＳｔｕＩ片段被克隆到　（Ｏｘｏｉｄ胰胨豆汤粉３０　ｇ，蔗糖１０３　ｇ，酵母抽提物５　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（＋）的Ｓｍａ／位点上，得到质粒ｐＪ—　ｇ，蒸馏水１０００　ｍＥ）液体培养。ＭＳ（黄豆饼粉２％，甘　ＴＵ１０６６。根据基因ｏｚｍＦ的序列设计了寡核苷酸引物　露醇２％，水１０００　ｍＬ，灭菌两次）用于链霉菌固体培　５　一ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＴＣＡ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＧＡＧ　养、接合转移和固体发酵【ｌ１］。　ＣＣＧ　ＣＴＣ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ａｔｔ　ｃｃｇ　ｇｇｇ　ａｔｃ　ｃｇｔ　ｃｇａ　ＣＣ一３　１．３　ＰＣＲ　（ｏｚｍＦ—ＦＰ１）和５　一ＴＣＡ　ＧＧＧ　Ｃ＇Ｉ＇Ｔ　Ｃ＇Ｉ＇Ｔ　ＧＴＧ　ＧＡＣ　ＰＣＲ是由ＨＹＢＡＩＤ　ＰＣＲ仪器完成的。典型的　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＧＴＣ　ＧＧＣ　ＧＡＣ　ｔｇｔ　ａｇｇ　ｃｔｇ　ｇａｇ　ＰＣＲ反应条件为：１．５　ｍｍｏｌ－Ｌ—ＭｇＣ１２，５　ｎｇ白色链霉　ｃｔｇ　ｃｔｔ　ｃ一３　（ｏｚｍＦ－ＲＰ１）。以ｐＩＪ７７８为模板，用这对　菌总ＤＮＡ或者是质粒ＤＮＡ，５％ＤＭＳＯ，１００　ｔｘｍｏｌ・　引物扩增壮观霉素抗性基因匣子（ｓｐｃ），得到的ＰＣＲ　Ｌ—ｄＮＴＰｓ，２５　ｐｍｏｌ引物以及ＰＣＲ缓冲液。在添加了　产物通过电转化方式导入携带有质粒ｐＪＴＵ１０６６的大　５　Ｕ　ＤＮＡ聚合酶以后，将ＤＮＡ模板变性３　ｍｉｎ。然后　肠杆菌ＢＷ２５１１３／ｐｌＪ７９０之中．经过ｓｐｃ抗性匣子和　扩增３Ｏ个循环（９４　ｃＣ变性４５　ｓ，５５　ｃＣ复性１　ｍｉｎ，７２　质粒ｐＪＴＵ１０６６之间入一ＲＥＤ介导的双交换重组产生　维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期赵春华．等：白色链霞菌ＪＡ３４５３中垩唑霉素生物合成基因簇甲氧丙二酰ＡＣＰ生物合成基凶ｏｚｎｌＦ的遗传分析　１９　突变质粒ｐＪＴＵ１０６８（ＡｏｚｍＦ：：ｓｐｃ），其中ｏｚｍＦ内部１９６　个氨基酸（从１４到２０９）的片段被ｓｐｃ抗性匣子所取　为了互补突变株ＺＩｔ６的ｏｚｍＦ的缺失突变，通　过ＯＣ３１衍生的整合型质粒ｐＪＴＵ１３５１，构建了ｏｚｍＰ　表达载体ｐＪＴＵ１０８０。首先通过ＰＣＲ从ｐＪＴＵ１０５９用　代。接着，我们使用了ＦＬＰ重组系统㈣从ＡｏｚｍＦ．．＇：ｓｐｃ　突变质粒中去除ｓｐｃ抗性匣子。ｐＪＴＵ１０６８被导入Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｃｄＢＴ３４０．在４３　条什下ｓｐｃ抗性匣子被　ＦＬＰ重组酶切除，产生质粒ｐＪＴＵ　１０７０。突变的ＡｏｚｍＦ　基因以一个５．９　ｋｂ　ＳｐｅＩ—ＫｐｎＩ片段从ｐＪＴＵ１０７０转到　如下引物扩增出ｏｚｍＦ：５　一Ｇ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＴＣＡ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　Ｇ一３　ｆｏｚｍＣ—ＦＰ３，下划　线为ＮｄｅＩ位点）　和５　一Ａ　ＧＡＡ　ＴＩ＂Ｃ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＧＣ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＴＧＣ　ＴＦＣ　Ｃ－３　（ｏｚｍＣ－ＲＰ３，　ｐＯＪ２６０的相同位点上，产生ｐＪＴＵ１０７２。最后通过链霉　菌一大肠杆菌接合转移ｌ１１】的方法将质粒ｐＪＴＵ１０７２导　下划线为ＥｃｏＲＩ位点）。得到的ＰＣＲ产物经由　Ｉ　和ＥｃｏＲＩ酶切后得到６９３　ｂｐ的片段被克隆到　入白色链霉菌ＪＡ３４５３，对接合转移子筛选双交换同　源重组子，得到的缺失了基因ｏｚｍＦ的突变菌株ＺＨ６。　突变菌株预期的基因型通过ＰＣＲ分析进一步得　到确定。对于突变株ＺＨ６的验证，设讨‘了如下引物：　５　一ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＡＣＣ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴ一３　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ的相同位点上，通过测序验证了ＰＣＲ　过程中没有引入错误的碱基。然后将ｏｚｍＦ从　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ亚克隆上用Ⅳ　Ｉ—ＥｃｏＲＩ切除下来并　克隆到ｐＪＴＵ１３５ｌ的相同位点上，将ｏｚｍＦ置于　ＥｒｍＥ￣启动子的之下，产生质粒ｐＪＴＵ１０８０。ｐＪ—　（ｏｚｍＦ－ＦＰ２）和５　一ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　Ｇ　ＦＡ　ＴＧＣ　ＴＵ１０８０通过接合转移导入突变株ＺＨ６，通过筛选得　到的阿伯拉霉素抗性的接合转移子ＺＨ８。以ＪＡ３４５３　作为正对照．ＨＰＩ　Ｃ分析表明ＺＨ８部分回复了　（４０％）ＯＺＭ的产　￡（野生型ＪＡ３４５３的ＯＺＭ产量为　１０～１５　ｍｇ・　）。所有的ＯＺＭ通过ＥＳＩ—ＭＳ分析，其　特征（Ｍ＋Ｉ１）离子ｍ／ｅ为６５６．１，与分予式Ｃ３６Ｈ∞Ｎ３Ｏ９　ＧＧＴ　ＧＡ一３　（ＯＺＤＺ￣’一ＲＰ２），以白色链霉菌ＪＡ３４５３和　ＺＨ６的总ＤＮＡ为模块用该引物进行ＰＣＲ扩增，结果　白色链霉菌ＪＡ３４５３中的１．６　ｋｂ的信号，在ＺＨ６巾由　于缺失了ｏｚｍＦ内部５８８　ｂｐ的片段后变为１．１　ｋ１）。琼　脂糖凝胶电泳检测结果与预期的相符合　对ＪＡ３４５３　和ＺＨ６发酵产物进行ＨＰＬＣ分析，与ＪＡ３４５３相比，　ＺＨ６不再产生ＯＺＭ（图２）。　相一致，而且通过　Ｈ和　Ｃ的ＮＭＲ分析，与以前报　道的文献数据完全一致　（　２）。　Ｉ１１１１［＝＝＝】薹　Ｘ．．　ＦＰ　１．ｅ　—ＲＰ　，ｆ＝二匦　１Ｉ＝塑　ｌＩ＝　匝　．　＝＝］玎田＆ａ曲∞ＪＡ３４５３　Ｘ　　．　．＼、：　：：—／／　Ⅱ　叩口［＝＝二＝］霹　二］叩口Ｓ．ａＪｂｕｓｚＨｅ　Ａ　Ｂ　（：　图２白色链霉菌ＪＡ３４５３衍生菌株的构建．ＰＣＲ证明和ＩｔＰＬＣ分析　Ｆｉｇ．２　ｔｔＰＬＣ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓ．ａ／ｂ“　ＪＡ３４５３　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎ．ＰＣＲ　ａｎｄ　ＨＰＩ　Ｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　（Ａ）图示通过双交换同源重组分离突变株ＺＨ６。（Ｂ）野生型ＪＡ３４５３和突变菌株ＺＩｔ６基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ分析。泳道Ｉ，１　ｋ１）ｌａｄｄｅ；泳道２，　ＪＡ３４５３用ｏｚｍＦ—ＦＰ２和ｏｚｍ｝　一ＲＰ２扩增的产物；泳道３，ＺＨ６用ｏｚｍＦ—ＦＰ２和ｏｚｍＦ—ＲＰ２扩增的产物。（Ｃ）ＨＩ　ＬＣ分析ＯＺＭ产生。白色链霉菌　ＪＡ３４５３野生型菌株（Ｉ），重组菌ＺＨ５（ＩＩ），ＺＨ６（ＩＩＩ），和ＺＨ８（ｉｖ）。　（Ａ）Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｌａｔｌｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＺＨ６　ｎｌｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｖｉａ　ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．（Ｂ）ＰＣＩ／ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡｓ．Ｌａｎｅ　１，１　ｋｂ　ｌａｄｄｅｒ；Ｌａｎｅ　２，ＪＡ３４５３　ｗｉｔｈ　ｏｚｍＦ－ＦＰ２　ａｎｄ　ｏｚｍＦ－ＲＰ２；Ｌａｎｅ　３，ＺＨ６　ｗｉｔｈ　ｏｚｍＦ－ＦＰ２　ａｎｄ　ｏｚｍＦ－ＲＰ２．　（Ｃ）ＨＰＬＣ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｓ．ａｌｂｕｓ　ＪＡ３４５３　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ（Ｉ）ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ＺＨ５（Ｉ１），ＺＨ６（１１１），ａｎｄ　Ｚｌｔ８（ＩＶ）　缺失．不能合成氧甲基化的延伸单位甲氧丙二酰一　３　讨论　以杂合聚酮聚肽作为模型研究天然产物的合成　是为了了解聚酮和聚肽合酶是如何合成杂合化合物　的分子机制ｌ　１　ＯＺＭ具有独一无：二的化学结构和有用　的生物活性。因此可以作为组合生物合成的优良前　体。实验中我们通过遗传学证明了ｏｚｍＦ确实是ＯＺＭ　生物合成的必须基因．很可能负责Ｃ３和Ｃ４延伸单　位氧元素的甲基化。由于在突变株ＺＨ６里该基因的　ＡＣＰ，因此就不能合成完整的ＯＺＭ分子。同时互补实　验也证实了ＺＨ６不能产生ＯＺＭ确实是因为缺失了　基因ｏｚｍＦ．而不是由于染色体上其他的突变　在本研　究中．采用了　一ＲＥＤ和ＦＩ　Ｐ重组技术，显示了它们在　微生物遗传学中的价值Ｉｌ０】。　（下转第２４页）　维普资讯 http://www.cqvip.com 上海交通大学学报（农业科学版）　第２６卷　荠芋在各自群落中较少形成优势种；（４）灌木层与草　物生态学报，１９９９，２３（１）：１４＿２２．　本层构成了群落主体。但两者在不同群落中互有优　［５］ＧＥ　Ｙ，ＣＨＡＮＧ　Ｊ．Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｏｌｓａ　势。在灌木层较为充分的群落中．其草本植物就相对　ｈａｎｇｃｈｏｗｅｎｓｉｓ，ａｎ　ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　ＢｕＨｅｔｉｎ　较弱；小型叶、草质叶在群落中占绝对多数．大型叶、　Ａｃａｄｅｍｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００１，４２：１４１－１４７．　薄叶植物在群落占比极少．石荠芋属植物生长在水热　［６］ＧＥ　Ｙ，ＣＨＡＮＧ　Ｊ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ１　ｅｔ　１ａ．Ｅｔｉｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｒｒａｄｉａｎｃｅ　ｏｎ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｍｏｓｌａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　条件差异较大的环境中。　群落结构和物种多样性研究能反映出植物的生　ａｎｄ　ｓｃａｂｒ４Ｊ】．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ，２００５，４３（１）：１１１－１１５．　［７］ＧＥ　Ｙ，ＬＵ　Ｙ　Ｊ，ＬＩＡＯ　Ｊ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｏｆ　态分布和生态适应性。石荠芋属植物在物种分化上具　Ｍｏｓｌａ　ｈａｎｇｃｈｏｗｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｉａｎｔｈｅｒａ　ａｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｓｏｉｌ　有较典型的意义。一年生植物石荠芋属的生态分化从　ｍｏｉｓｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ，２００４，４２（３）：３８７－３９１．　群落学方面研究是一种手段．能够阐明物种对环境的　［８］周世良，潘开玉，洪德元．杭州石荠芋和石香薷（唇形科）的传　适应变化。了解和分析群落结构。能够更全面地分析　粉生物学比较研究［Ｊ］．植物学报，１９９６，３８（７）：５３０—５４０．　种群的消长机理．为进一步从生理生态学方面研究提　［９］周世良，张方，王中仁．杭州石荠芋和石香薷的遗传多样　供依据。　性研究［Ｊ］．遗传学报，１９９８，２５（２）：１７３—１８０．　［１０］周世良，潘开玉，洪德元．传粉对杭州石荠芋（唇形科）结实　参考文献：　的影响［Ｊ］．云南植物研究，１９９８，２０（４）：４４５－４５２．　［１１］周世良，陈新．杭州石荠芋的传粉、小坚果散布和邻群大　［１］吴征镒，李锡文．中国植物志（第６６　［Ｍ］．北京：科学出版　小［Ｊ］．广西植物，２００２，２２（４）：３３７—３３９．　社，１９７７：２８７—３００．　［１２］周世良，潘开玉，洪德元．杭州石荠芋（唇形科）小坚果的散　［２］周世良．石荠芋属的遗传分化与种间关系［Ｊ］．植物分类学　布生物学研究［Ｊ］．广西植物，１９９８，１９（２）：１７６—１７９　报，１９９９，３７（１）：１０—１９．　［１３］宋永昌．植被生态　Ｍ］．上海：华东师范大学出版社，２００１．　［３］常杰，，刘珂，葛滢．杭州石荠芋光合特性及其对土壤　［１４］Ｗｒｉｇｈｔ　Ｓ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ　水分的响应［Ｊ】．植物生态学报，１９９９，２３（１）：６２—７０．　ｍａｔｉｎｇ［］Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９４６，３　１：３９—５０．　［４］葛滢，常杰，陆大根．杭州石荠芋生态学特性研究［Ｊ］．植　ｆ上接第１９页）　参考文献：　ｎｅｍａ　ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ［］Ｊ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００２（９９）：７９６８－　［１］Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　Ｂ，Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ　Ｊ．Ｍｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｎａｔｕｒｌａ　７９７３．　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ［］Ｊ．Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，２００７（３）：　［８］Ｃａｒｒｏｌｌ　Ｂ　Ｊ，Ｍｏｓｓ　Ｓ　Ｊ，Ｂａｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｅｔ　ｏｆ　３７９—３８６．　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｃｏｒ　［２］Ｓｈｅｎ　Ｂ．Ｐｏｌｙｋｅｉｔｄｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｅｙｏｎｄ　ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　Ｉ，ＩＩ，ａｎｄ　ＨＩ　ｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｕｎｕｓｕａｌ‘‘ｇｌｙｃｏｌａｔｅ”ｃｈａｉｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｕｎｉｔ　ｉｎ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｐａｒａｄｉｇｍｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，　ａｎｓａｍｉｔｃｏｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［］Ｊ．Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ，２００２（１２４）：　２００３（７）：２２８５－２９５．　４１７６－４１７７．　［３］Ｍｏｏｔｚ　Ｈ　Ｄ，Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ　Ｄ，Ｍａｒａｈｉｅｌ　Ｍ　Ａ．Ｗａｙｓ　ｏｆ　ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　［９］Ｚｈａｏ　Ｃ，Ｊｕ　Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　１ａ．，Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｎ　ｍｏｄｕｌａｒ　ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｅｔｈｏｘｙｍａｌｏｎｙｌ－ａｃｙｌ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｌｏｃｕｓ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｂｉｃｏｈｅｍ，２００２（３）：４９０－５０４．　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｘａｚｏｌｏｍｙｃｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐ　［４］Ｗａｌｓｈ　Ｃ　Ｔ．Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｔｉｂｉｏｉｔｃｓ：　ｔｏｍｙｃｅｓ　６　ＪＡ３４５３［］Ｊ．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００６，１８８（１１１：４１４２—４１４７．　ｍｏｄｕｌａｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４（３０３）：１８０５—１８１０．　［１０］Ｇｕｓｔ　Ｂ，Ｃｈａｌｌｉｓ　Ｇ　Ｌ１　Ｆｏｗｌｅｒ　Ｋ，ｅｔ　１ａ．ＰＣＲ—ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔｏ　【５］Ｍｏｒｉ　Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｋａｓｈｉｗａｂａｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｏｘａ　ｍｙｃｅｓ　ｇｅｎｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｎｅｅｄｅｄ　ｚｏｌｏｍｙｃｉｎ，ａ　ｎｏｖｅｌ？一ｌａｃｔｏｎｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ［］Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ，　ｏｆｒ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ　ｓｏｉｌ　ｏｄｏｒ　ｇｅｏｓｍｉｎ［Ｊ］．　１９８５（２６）：１０７３—１０７６．　Ｐｒｃｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００３（１０ｏ１：１５４１—１５４６．　［６］Ｇｒｆａｅ　Ｕ，Ｋｌｕｇｅ　Ｈ，Ｔｈｉｅｒｉｃｋｅ　Ｒ．Ｂｉｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｏｘａ　［１　１］Ｋｉｅｓｅｒ　Ｔ，Ｂｉｂｂ　Ｍ　Ｊ，Ｂｕｔｔｎｅｒ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　１ａ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏ　ｚｏｌｏｍｙｃｉｎ，ａ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　（ｓｔｒａｉｎ　ＪＡ３４５３）　ｍｙｃｅｓ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，　［Ｊ］．Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ　Ｃｈｅｍ，１９９２（１７１）：４２９—４３２．　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００２．　［７］Ｙｕ　Ｔ　Ｗ，Ｂａｉ　ｋ　Ｃｌａｄｅ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　［１２］Ｓｔａｕｎｔｏｎ　Ｊ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ　Ｋ　Ｊ．Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｍｉｌｌｅｎ　ｈｔｅ　ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｇｅｎｔ　ａｎｓａｍｉｔｃｏｉｎ　ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｎｏｓｙｎ　ｎｉｕｍ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｐｒｏｄ　Ｒｅｐ，２００１（１８）：３８０－４１６．