08年--蛋白质组学技术筛选新的卵巢癌多药耐药靶向蛋白的研究进展

󰀁综述󰀁

蛋白质组学技术筛选新的卵巢癌多药耐药靶向蛋白的研究进展

刘媛媛󰀂综述,李󰀂力,马󰀂刚󰀂审校

(广西壮族自治区人民医院妇产科,南宁󰀂530021)

󰀂󰀂 摘要!󰀂卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,化疗耐药是影响卵巢癌患者预后的主要原因。近年基因组工程从DNA和RNA水平阐明了多药耐药的遗传基础,但是,未能精确描述肿瘤耐药细胞在蛋白质水平所发生的一切。肿瘤蛋白质组学的出现及其研究技术的发展和完善使在蛋白质整体水平上研究多药耐药产生的机制成为可能。现结合国外近5年的研究,对利用蛋白质组学技术筛选新的卵巢癌多药耐药靶向蛋白作一综述。

󰀂󰀂 关键词!󰀂卵巢肿瘤;多药耐药;肿瘤蛋白质组学;靶向蛋白

󰀂󰀂中图分类号:R737.33󰀂文献标识码:A󰀂文章编号:1004-7379(2009)07-0553-03󰀂󰀂肿瘤的多药耐药机制十分复杂,已发现的耐药相关蛋白有P󰀁gp糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白等,但不能完全解释肿瘤多药耐药现象。因此,有必要用新方法和技术开展肿瘤多药耐药性研究。蛋白质组学是后基因组时代的一门新学科,其目的是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分,了解蛋白质之间的相互作用和联系,揭示蛋白质功能和生命活动规律。蛋白质组学的出现及其理论和技术的发展和完善对卵巢癌具有广阔的临床应用前景,不仅有利于寻找特异的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期筛查,而且为研究肿瘤细胞的多药耐药机制、筛选肿瘤耐药相关蛋白提供了全新的手段。

1󰀂蛋白质组学的概念及意义

蛋白质组学是一个动态概念,具有高度动态性及细胞特异性。目前对蛋白质组学的定义是:机体在特定时期、状态以及环境等条件下对所有蛋白质表达形式的研究,即蛋白质组学。其目的是从整体角度分析机体内动态变化的蛋白质之间相互作用和联系,揭示蛋白质功能与生命活动的规律。2󰀂蛋白质组学的分类

蛋白质组学的研究分为:(1)差异表达蛋白质组学,是观察某种细胞或组织中大量蛋白质的整体表达,并分析在不同情况下表达图谱的变化。目前最常用的技术是双向凝胶电泳、质谱分析、蛋白质芯片和生物信息学技术;(2)功能蛋白质组学,又称细胞图谱蛋白质组学,旨在定义蛋白质间的相互作用,以建立细胞内信号转导通路的复杂网络图。如酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、表面等离子技术和荧光能量转移技术等。本文主要概述差异表达蛋白质组学在筛选卵巢癌多药耐药新的靶向蛋白方面的研究。

3󰀂差异表达蛋白质组学的常用技术及在筛选新的卵巢癌多药耐药靶向蛋白上的应用3.1󰀂双向凝胶电泳(twodimensionalelectrophoresis,2󰀁DE)󰀂目前蛋白质分离通常采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2󰀁DE)、亲和层析、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳和反相高效液相色谱等。其核心技术是2󰀁DE,它是迄今研究蛋白质

丰度和翻译后修饰最为广泛的方法。此法的缺点是费时费力,重复性差,并且难以检测低表达量的蛋白。

3.1.1󰀂双向凝胶电泳筛选卵巢癌多药耐药新的靶向蛋白󰀂双向电泳技术可用于蛋白质转录及转录后修饰研究、蛋白质组比较和蛋白质间相互作用等许多方面。现主要介绍在筛选差异蛋白方面的应用。Yan等[1]建立了人卵巢癌铂类耐药株SKOV3/CDDP、SKOV3/SBP、A2780/CDDP、A2780/CBP,并用双向凝胶电泳技术观察上述细胞株的蛋白质分子表达的差异。筛选了57个差异条带,其中5种蛋白同时在上述4种细胞株中表达,它们是:膜联蛋白A3(annexinA3),细胞骨架蛋白(destrin),丝切蛋白󰀁1(cofilin1),谷胱甘肽S转移酶󰀁1(Glutathione󰀁S󰀁transferaseomega1,GSTO1󰀁1)和细胞质

+

NADP依赖的异柠檬酸脱氧酶(cytosolicNADP+󰀁dependentisocitratedehydrogenase,IDHc)。annexinA3为肝细胞生长所必须,任何抑制肝细胞生长的因素均能降低annexinA3的表达。反之,肝细胞生长因子和表皮生长因子都能刺激annexinA3的表达[2]。还有文献报道,annexinA3在正常的前列腺上皮细胞中表达,在前列腺癌的癌前组织中则表达增高,表明annexinA3可以作为潜在的暗示癌症发生的标志[3]。谷胱甘肽S转移酶(glutation󰀁s󰀁transferase,GST)是广泛存在于动植物体内的II相代谢酶的一个大家族,GST在许多类型的恶性肿瘤中均有很高表达。GST表达与肿瘤对烷化剂药物的敏感性有一定的相关性。人胞质GST具有基因多态性,GS󰀁TO1属于其中的一个亚型。细胞内的谷胱甘肽(glutathione,GSH)系统是药物解毒作用的关键。GST参与GSH分子上硫原子对各种内源性和外源性底物(包括各种抗癌药物)的亲核进攻,催化GSH与底物结合,形成水溶性更高、更易排泄的复合物,使底物利于从胆汁或经肾脏排泄,所以,当GST表达增加或活性增强时,药物排泄也随之增加,从而引发耐药性的产生。在过去的20年里,大量数据已将GST同工酶异常表达与肿瘤对抗癌药物耐受性的发生联系起来。既然GS󰀁TO1属于其中的一个亚型,所以我们有理由推测它也是通过类似途径参与了耐药的发生。经过RT󰀁PCR和Westernblot󰀁

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ting验证发现结果与2󰀁DE的结果一样。所以设想上述5种蛋白可以成为铂类耐药的蛋白标志物,对以后进一步研究铂

类耐药机制有重要作用。

LeMoguen等[4]应用2󰀁DE结合MALDI󰀁TOF󰀁MS技术在人卵巢癌敏感细胞株IGROV1和顺铂耐药细胞株IGROV1󰀁R10中筛选差异表达蛋白。发现细胞角蛋白8、18(cytokera󰀁tins8、18)及醛脱氢酶1(aldehydedehydrogenase1)在耐药细胞株IGROV1󰀁R10中高表达,而膜联蛋白IV(annexinIV)表达量降低。目前尚无上述蛋白与卵巢癌多药耐药相关关系的报道。

3.2󰀂差异凝胶电泳󰀂传统蛋白质组学是应用双向凝胶电泳质谱分析及生物学信息对特定时间,特定条件下基因表达的全套蛋白质进行研究的科学。虽然双向凝胶电泳以其高分辨率和兼具微量制备的性能成为蛋白组学研究中不可替代的分离方法,但仍有局限性。为进一步提高2󰀁DE的重复性及工作效率,差异凝胶电泳(differentialingelelectrophoresis,DIGE)技术应运而生[5󰀁7]。其优点是(1)设有内标,使得多个样本之间可以直接进行量的比较;(2)使用3种不同荧光染料分别标记内标,避免了不同批次胶与胶之间的误差,反映了蛋白质的真实改变程度,降低了假阳性率及假阴性率;(3)人为因素干扰少实现高通量及实验具准确性。国外尚无利用该技术筛选卵巢癌多药耐药新的靶向蛋白的报道。3.3󰀂生物质谱技术󰀂生物质谱技术是蛋白质分析鉴定的核心技术。目前应用最广泛的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI󰀁TOF󰀁MS),正如上述,在肿瘤研究中,MALDI󰀁TOF󰀁MS都是与2󰀁DE、ICAT等结合起来对差异蛋白进行鉴定,依托大规模2󰀁DE󰀁MS、ICAT/MS/MS系统,可筛选和鉴定出新的卵巢癌多药耐药的相关蛋白。

3.4󰀂同位素编码亲和标签(ICAT)󰀂基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准,与另一状态的蛋白混合物酶解,理论上所有多肽都有一段与它序列相同但质量不同的\"分析对\这一质量差异正是同位素标记造成的,这些多肽的理化性质完全相同,在任何分离方法中的行为也相同。因此,在质谱图中一系列成对的高低质量峰间的强度比值就提供了初始蛋白混合物中多肽、蛋白质相对量的精确信息,现在已成为差异蛋白组学中的主要技术。这一方法克服了2󰀁DE的许多缺点,可以精确检测疏水的膜蛋白、PI和分子量偏大或偏小的蛋白,使它的分析范围远大于2󰀁DE。

3.4.1󰀂同位素编码亲和标签在筛选卵巢癌耐药蛋白上的应用󰀂Stewart等[8]应用同位素编码亲和标签结合串联质谱的方法(ICAT/MS/MS)对比了铂类敏感细胞株IGROV󰀁1和铂类耐药细胞株IGROV󰀁1/CP之间蛋白表达的差异。发现63种蛋白在IGROV󰀁1中高表达,包括肝细胞生长因子抑制剂1B、细胞凋亡相关蛋白等;58种蛋白在IGROV󰀁1/CP高表达,包括细胞识别分子CAPR3、S100蛋白家族成员、黏附分子和CAC42󰀁结合蛋白酶、细胞死亡6󰀁间安亭蛋白(Cell󰀁death6󰀁interactingprotein)等与癌症相关的蛋白。CASPR3蛋白属于神经系统细胞识别家族,这个蛋白在神经系统的细胞识别方面起很重要的作用[9],但是它的生物功能仍属未知。Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子量G蛋白的成员之一,目前已

发现3个亚家族共十余种。这是一组分子量大约为20~25kD的鸟苷酸(GTP)结合蛋白,具有GTP酶活性。在细胞信号转导通路中作为信号转换器或分子开关,作用于细胞骨架或其靶蛋白)而产生多种生物效应。Cdc42是Rho家族中研究得较多的一个,它在调节细胞骨架、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡、细胞转录、细胞转化、恶性肿瘤细胞的浸润和转移等方面发挥重要作用。推测Cdc42通过与细胞内的氧化酶和过氧化物产物相互作用抑制肿瘤细胞对凋亡的反应从而抵制了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用[10,11]。Cell󰀁death6󰀁interactingprotein:这个蛋白参与了细胞程序性死亡,高表达这个蛋白可以阻断细胞凋亡的发生。此外,这个蛋白在细胞内吞作用中调节细胞基膜形态。高表达该蛋白导致细胞质形成空泡,在某种意义上防止了细胞凋亡的发生。推测该蛋白在化疗耐药中的机制与细胞凋亡有关。提示这些蛋白可能调节癌细胞对铂类的敏感性,从而为选择药物提供帮助。

3.5󰀂SELDI蛋白质芯片󰀂蛋白质芯片又称蛋白质微阵列,是继基因芯片之后又一新型的生物芯片,最早由德国科学家Lueking等[12]开始研究。SELDI蛋白芯片由芯片,样品处理系统和数据分析系统3部分组成。其原理是利用激光脉冲辐射使芯片池中的分析物解析成荷电离子,根据不同质荷比这些离子在仪器磁场中的飞行时间长短不一,由此绘出质谱图,由软件分析出各种蛋白质的分子量和含量等信息。若将卵巢癌化疗敏感组和耐药组的蛋白图谱对比,即可捕获与化疗耐药特异性相关的生物标志蛋白。该技术重复性好,处理的信息量大,定量分析蛋白质,适用于低丰度蛋白质或多肽的检测以及基础医学研究、临床诊断及大规模人群筛选。3.5.1󰀂蛋白质芯片在筛选卵巢癌多药耐药靶向蛋白中的应用󰀂Britten等[13]利用SELDI蛋白质芯片筛查唯一存在于卵巢癌顺铂耐药细胞株(OAW42和A2780)中与顺铂耐药相关的蛋白。结果发现,只有两种M/Z比值为5041和7324的两个峰,它们恒定地在与顺铂耐药相关的细胞株中表达。虽然这两个峰对应的蛋白质未知,但是,可以肯定的是它们是与铂类耐药相关的两个蛋白质。提示SELDI蛋白质芯片在筛选铂类耐药肿瘤细胞中的差异克隆上有不可忽视的作用。Zhu等[14]使用相同方法筛选出顺铂敏感株(KF󰀁1,MN󰀁1,andA2780)和顺铂耐药株(KF󰀁r,MN󰀁r,andA2780cp)中12种差异表达的蛋白。其中,分子量7829d的蛋白在顺铂耐药株中表达下调;分子量为6881d的蛋白在KF和MN细胞的敏感和耐药株之间有明显的差异。

3.6󰀂生物信息技术󰀂生物信息学是随着人类基因组计划、计算机技术、网络技术的发展而诞生的一门新兴学科,是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学在蛋白质组学研究中有两个重要应用:一是分析和构建双向凝胶电泳图谱,二是搜索与构建蛋白质组数据库。

造成卵巢癌患者高死亡率的主要原因之一是化疗耐药,我们可以利用蛋白组学技术,通过对卵巢癌耐药或敏感细胞株蛋白质图谱的比较来寻找与卵巢癌多药耐药相关的蛋白质,并以此特异表达蛋白质作为靶点,开发抑制该蛋白表达的制剂或设计联合用药的新方案,这对寻找新的卵巢癌治疗

554现代妇产科进展2009年7月第18卷第7期󰀂ProgObstetGyneco,lJuly2009,Vol󰀂18,No󰀂7靶点、阐明卵巢癌发生发展机制都将产生重大影响。

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