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安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａ ，Ｓｅｉ．２ｆＤ６，３４｛２２）：５８７７—５８７８ 责任编辑陈娟责任校对张瑜 鸡源致病性大肠杆菌分离株的药敏试验及灭活疫苗制备 杭柏林，李杰，王丽荣，梁美兰，王承民（河南科技学院动物科学学院，河南新乡４５３０∞） 摘要时疑似大肠杆菌痛的病死鸡进行了病原分离鉴定、药敏试验及灭活疫苗的研制。结果表明，病原为高致病性大肠杆菌，对阿米卡 星、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考极敏感，对链霉素、痢特灵、呋喃妥因高度敏感，对土霉素、强力霉素、盐酸四环素、甲砜霉素中度敏感，对 复方新诺明、头孢噻呋耐药，对诺氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、青霉素、红霉素不敏感。对分离茵经纯化增茵后制备的灭活苗经安全检 验、效力检验后表明，该疫苗对鸡安全有效，无不良反应。 关键词鸡；大肠杆菌；药敏试验；灭活疫苗 中图分类号￥８５２ ６ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６１１（２Ｏ０６）２２—５８７７—０２ 鸡大肠杆菌病是由某些血清型病原性大肠杆菌（ ， ｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）菌株引起的一类疾病的总称。该病可发生于各 品种和各日龄的鸡，一年四季均可发生，尤以冬季和夏季多 发。由于年龄、抵抗力、病原毒力、感染途径等不同，在临床 症状一ｊ 表现多样，如败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、脐炎、 关节炎、脑炎、全眼球炎、输卯管炎、腹膜炎、肉芽肿等，发病 率和死亡率高，且常与其他呼吸道疾病如慢性呼吸道病并发 或继发感染而使死亡率升高。鸡大肠杆菌病已成为危害养 鸡业的重要疾病之一，造成了严重的经济损失。笔者对送检 的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培 养特性、致病力、抗菌药物的筛选及灭活疫苗进行研究，以期 为有效预防和控制该病提供依据。 １材料与方法 １．１病鸡及试剂来源供试病鸡为河南省新乡市某鸡场疑 似大肠杆菌病的病、死肉鸡若干只，鸡死亡时间不超过１２ ｈ。 培养基和微量鉴定管购于杭州微生物试剂有限公司。药敏 试纸片自制，各种抗生素由河南科技学院药理实验室提供。 未免疫ＡＡ肉鸡购于新乡市郊区某鸡场。 １．２细菌分离培养无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组 织，接种在普通琼脂平板及普通肉汤，３７ 培养２０ ｈ，抹片， 革兰氏染色后镜检。挑取表面光滑，边缘整齐，灰白色半透 明的单个小菌落划线接种于麦康凯和伊红美兰琼脂平板上， ３７ ｃｃ培养２０ ｈ…。 １．３细菌形态学观察取在麦康凯琼脂平板上培养２０ ｈ的 新鲜菌落，抹片，并进行革兰氏染色镜检。 １．４生化试验糖发酵及生化反应按参考文献［２］的方法 进行。 １．５致病力测定 １．５．１菌液制备。将分离菌接种于营养肉汤，３７℃培养２０ ｈ，４ ℃保存备用。用平板计数法测定其数量，２．４×１ ＣＦＵ／ｍｌ。 １．Ｓ．２动物试验 。将１Ｏ只１日龄ＡＡ肉鸡，饲养２周，临 床健康，随机分为两组，每组５只。试验组颈部皮下接种菌 液Ｏ．２ ｎ１１；对照组腹腔接种灭菌生理盐水０．２ ｒｎｌ，隔离饲养。 接种后观察８ ｄ，记录死亡情况，并取接种鸡的肝及心血进行 病原的再分离。 １．６药敏试验在无菌条件下，将２４ ｈ肉汤培养物用灭菌 基金项目 河南科技学院青年科学基金资助项目 作者简介 杭柏林（１９７８一），男。江苏南通人，硕士，讲师，从事动物微生 物学研究 ， 收稿日期 ２００６－ｏ８—２７ 生理盐水作１Ｏ倍稀释，取０．２『ｎ１滴加在普通琼脂平板上，用 灭菌Ｌ棒涂匀，然后贴上纸片，置３７℃温箱中培养１８ ｈ，用游 标卡尺测量抑菌圈直径。判定标准＿４ Ｊ：抑菌圈直径大于２ｏ ｉ／ｌｉ＇ｎ为极度敏感，ｌ５．１～２０ｎｆｉｎ为高度敏感，ｌ０．１ １５ ｎｆｉｎ为中 度敏感，０—１０ ｎ１ｎ１为耐药。 １．７灭活疫苗的制备＿５ Ｊ １．７．１细菌增殖。将分离出的大肠杆菌菌株接种于普通琼 脂斜面培养基，３７ 培养１８ ｈ，再转接于肉汤培养基，３７ 培 养１８ ｈ，取出按比例１：ｌｏ（ｖ／ｖ）接种于大批量普通肉汤，３７ 培养７２ ｈ。 １．７．２纯度检查。每瓶样品用改良沙氏培养基、马丁肉汤 琼脂斜面接种上述菌株悬液０．２ ｎ１ｌ，厌氧肉肝汤和马Ｔ肉汤 各接种菌株悬液０．５ ｍｌ，改良沙氏培养基置２０ ３０ 培养， 其余均在３７ ｃＩＣ培养。培养７ ｄ后，从厌氧肉肝汤和马丁肉汤 培养液中吸取适量移植于厌氧肉肝汤、马丁肉汤琼脂斜面各 １支，继续于３７℃培养７ ｄ，若无杂菌生长，判定为合格。 １．７．３灭活。对上述合格的菌株悬液按０．５％的比例加入 甲醛，封口混匀后３７℃培养４８ ｈ。 １．７．４无菌检查。取灭活菌液分别接种厌气肝汤、普通肉 汤，３７℃培养７ ｄ，若无菌生长，则为合格。 １．７．５乳化。将灭活后的菌液按１：３比例与吐温－８Ｏ混合， 制成细菌悬液水相，再与司本一８Ｏ白油混合，置赢式胶体磨中 快速乳化成油包水状，置离心管以３ ０１３０ ｒ／ｒａｉｎ离心３０ ｍｉｎ，若 无分层则为合格，分装，４℃保存备用。 １．７．６安全检验。将灭活菌苗以３ ｍｌ／只，分别注射５只１ 日龄未免大肠杆菌菌苗的健康雏鸡颈部皮下，观察１５ ｄ，若 无不良反应 ０检脏器无异常变化，则证明疫苗安全。 １．７．７效力检验。选择健康、未感染、未接种相应疫苗的１４ 日龄ＡＡ肉鸡１Ｏ只，５只肌注自制灭活疫苗（Ｏ．２ ｍｌ／只），另５ 只肌注灭菌生理盐水（Ｏ．２ｍｌ／只）。１４ ｄ后，１Ｏ只鸡接种致死 量的活菌。１０ ｄ后，对照组应发病及死亡，而疫苗免疫动物 应健康存活。 ２结果与分析 ２．１病鸡及病死鸡的剖检变化肝脏肿大、质脆，有点状坏 死灶，表面覆盖有黄白色的纤维素性渗出物；心包有黄白色 渗出液；气囊上有纤维素性渗出物；脾脏肿大；肺脏充血、淤 血，有的肺脏有１—２ ｌｎｌｎ大小坏死灶；肾脏肿大，有尿酸盐沉 积；十二指肠有出血性变化；盲肠扁桃体肿胀、出血。 ２．２细菌染色及培养特性在肉汤中呈均匀混浊，管底有 黏性沉淀，液面管壁有茼环 在营养琼脂平板上菌落呈中等 维普资讯 http://www.cqvip.com
５８７８ 安徽农业科学 ２００６生 大小、圆形微隆起、表面光滑湿润、浅灰色、半透明状；在麦康 钝圆、多单个存在、无荚膜的革兰氏阴性短杆菌。 凯琼脂平板上，菌落呈粉红色、中等大小、表面光滑湿润；在 ２．３生化试验结果 由表１可知，分离菌株符合大肠杆菌 伊红美兰琼脂平板上，菌落呈黑色、有金属光泽、中等大小、 的生化特征，表明分离菌株为大肠杆菌【引。 圆形微隆起。原始病料和培养物涂片染色镜检，均可见两端 表１ 分离菌株生化试验结果 注：④为产酸产气，＋为 ，一为Ｉ；月性。 ２．４动物试验试验组鸡３ ｄ内全部死亡，剖检见有与原发 杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌，所以 病鸡相同的明显病变．心血、肝和脾均能回收到接种菌；对照 大肠杆菌的抗药性形成较快，环境中大肠杆菌的耐药性菌株 组全部健康存活，７ ｄ后剖检未见有病变。由此可见，所分离 越来越多 ８。药敏试验表明，该次分离的大肠杆菌对多种药 菌株具有高致病性＿３ Ｊ。 物产生了不同程度的耐药性。所以应根据药敏试验结果选 ２．５药敏试验由表２可知，此次分离的大肠杆菌对阿米 择敏感药物治疗大肠杆菌病，并注意更替用药，按疗程投药， 卡星、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考极敏感，对链霉素、痢特 才能有更好的治疗效果。笔者对发病鸡群用氟苯尼考和庆 灵、呋喃妥因高度敏感，对土霉素、强力霉素、盐酸四环素、甲 大霉素进行治疗，效果非常显著。 砜霉素中度敏感，对复方新诺明、头孢噻呋耐药，对诺氟沙 （３）大肠杆菌是条件性致病菌，防制关键在于加强饲养 星、恩诺沙星、沙拉沙星、青霉素、红霉素不敏感。 管理，做好各环节的卫生消毒，消除各种发病诱因。日常提 表２ 分离菌株对ｌ８种药物的敏感性 供全价优质饲料，并足量补充维生素和电解质；夏季要注意 药物 抑菌圈直径∥ｍｍ 药物 抑菌圈直径∥ｍｍ 防暑降温，添加抗应激饲料添加剂如碳酸氢钠、杆菌肽锌、、，ｃ 阿米卡星 ２ｌ 盐酸网环素 Ｉ２ 等；另外要严格执行卫生防疫措施，创造良好的饲养环境＿９Ｊ。 链霉素 １７ 红撵素 Ｏ （４）由于大肠杆菌血清型较多，特别是优势血清型存在 庆大霉索 ２３ 甲砜霉素 ｌ３ 差异，不同地区流行的血清型可能不同，因此接种通用菌苗 诺氟沙星０ 新霉索 ２２ 的效果不确定。筛选免疫原性优良的大肠杆菌地方菌株制 恩诺沙星０ 复方新诺明 ７ 沙拉沙星０ 痢特灵 ２０ 作菌苗，是预防鸡大肠杆菌病的有效措施之一。在血清型复 青霉素０ 呋喃妥冈 １９ 杂的地区，对于有条件的鸡场，最好采用该场分离的大肠杆 土霉素 ｌ２ 氟苯尼考 ２９ 菌菌株制备自家灭活疫苗，效果确实、可靠＿ｌ…。 强力霉素 ｌ４ 头孢噻呋 ８ 参考文献 ［１］曹澍泽．兽医微生物学及免疫学技术［Ｍ］．北京：北京农业大学出版 ２．６灭活疫苗的安全及效力检验安全检查的５只鸡全部 社，１９９２：８７—９５． 存活。无任何临床症状和病理变化，证明灭活疫苗安全。效 ［２］郭万柱．吴彤，陈瑶先．动 牧牛物学［Ｍ］．成都：四川科学技术出版社． １９９７：４０９ ４１６． 力检查的试验组鸡全部存活，而对照组鸡全部死亡，剖检变 ［３］高崧，吴长新，文其乙，等．不同地区ｌＯ１个禽源性大肠杆菌分离株的致 化与发病鸡相似。 病『生试验［Ｊ］．中国预防兽医学报，１９９９．２１（１）：１３—１６． ［４］朱模忠．兽药手册［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００２：４２—４３． ３讨论 ［５］王磊，万雪．鸡大肠杆菌的分离鉴定及疫苗的制备［Ｊ］．河北畜牧兽医， （１）大肠杆菌有致病性和非致病性菌株之分，因此分离 ２ＯＯ３．１９（１１）：１５一ｌ７． ［６］姜平．兽医生物制品学［Ｍ］，２版．北京：中国农业出版社，砌：ｌ盯一 鉴定出大肠杆菌后必须通过动物回归试验鉴定所分离的大 Ｉ８９． 肠杆菌是否有致病性。在分离鉴定及灭活疫苗的制备过程 ［７］陆承平．兽医微生物学［Ｍ］．３版．北京：中国农业出版社，２００１：２１５— ２２３． 中，必须严格无菌操作。在没有其他杂菌污染的情况下，可 ［８］有祥，李久芹，陈庆普．山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定［Ｊ］．中国预防 加快试验进程，提高分离鉴定结果的准确性及灭活疫苗的安 兽医学报，２ ，２４（１）：２１—２３． ［９］汪毅，刘永德，刘帅，等．鸡大肠杆菌分离鉴定与药敏试验［Ｊ］．上海畜 全性与有效性。 牧兽医通讯，２００１（４）：ｌ８一ｌ９． （２）在养鸡生产中，为控制细菌感染，于饲料中盲目添加 ［１０］王双山，张敬礼，刘庆昌，等．肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 ［Ｊ］．河南农、 科学，砌（６）：４３—４５． 一些抗菌药物，会导致耐药菌株越来越多并日趋严重。大肠 ＋・・＋”十“＋“＋ —＋一”＋”＋”＋”＋・・＋－・十・・＋“＋”＋”＋”＋”＋・－＋・・＋－・＋“＋“＋一・＋”＋”＋一＋・－＋”＋・・＋・－＋“＋・・＋－十”＋”＋”＋”＋・・＋・－ （上接第５８７３页） ［２７］ＨＥＮＤＲＩＣＫＳ ＨＢ．Ｒｅｌ￣ｉｏｎ ｐｏｒ￣ｎｅｍｕ￣ｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅ ａｎｄ ｓｉｚｅｔｏ ｐ￣ｅｒｎ ［２６］ＨＵＮＴＭＣ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｆｉｂｅｒｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｌ￣ｔ ｐｒｑｏｅｒｔｉ￣ ｆｉｖｅ ｂ０ｖｉｒ ｒＴⅡ】ｓｃｌ ｓｈ耐 ｎｇ［Ｊ］ＩＡｎｉｍ Ｓｅｉ，１９７１，３２：５７． ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ １９７７，４２：５１３． ［２８］ＳＩＮＮＫ Ｊ Ｄ．Ｒｉ ｎ￣ｒｉｆｓ ｐａｔｔｅｒｏ ｓｋｄａ￣ｍｔｍｅｌｅ ａｎｄ ｓａｒ∞ ｌｅｎｇｔｈ ｄ‘ｔｈｅ Ｈ咖 ｌ［Ｊ］．Ｂｉ￣ｈｅｍ Ｂｉｏｏｈ￣Ａｃ【ａ，１９６５，１￣：３０９．