流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

第３２卷第１０期　２０１０年ｌ０月　中国预防兽医学报　Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．１０　０ｃｔ．　２０ｌＯ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１０．１０．０６　猪流感病毒ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｌ定量ＲＴ—ＰＣＲ　检测方法的建立及应用　张鹏超　，－，师小潇１，３，哈　卓１，３，刘永杰　，刘惠莉　，，　（１．上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海２０１　１０６；２．南京农业大学动物医学院，江苏南京２１００９５；　３．上海市农业遗传育种重点实验室一Ｊ二海２０１　１０６）　摘　要：为研究猪流感病毒（ＳＩＶ）感染后ＳＩＶ在体内的分布规律，本研究设计针对ＳＩＶ　ＮＰ基因保守区引物，　建立了ＳＩＶ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ荧光定量ＰＣＲ方法。该方法对ＳＩＶ核酸检测灵敏度为３０　ＴＣＩＤ　，对健康猪肺组织　ｅＤＮＡ、猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）、猪蓝耳病病毒（ＰＲＲＳＶ）￣酸呈阴性反应。采用建立的荧光定量ＲＴ．ＰＣＲ方法对人工感　染Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２００７／Ｈ１Ｎ２（Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７）猪进行检测，结果显示：病毒在猪鼻腔粘膜持续存在至感染后第　８　ｄ；肛门拭子在感染后２　ｄ～８　ｄ可持续检测到病毒核酸；喉头、气管在感染后第３　ｄ可检到病毒核酸，并持续至　第１０　ｄ；肺部淋巴结、脾脏在感染后５　ｄ－－７　ｄ检测到病毒核酸阳性；其它脏器均未检测到病毒核酸，从而确定呼　吸道系统及脾脏是ＳＩＶ定殖的主要场所，ＳＩＶ感染猪后向外排毒周期约为１周。　关键词：猪流感病毒；ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ荧光定量ＰＣＲ方法：组织分布　中图分类号：￥８５２．６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—０５８９（２０１０）１０—０７６８　０５　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｒｅａＩ　ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｐｅｎｇ—ｃｈａｏ　，ＳＨＩ　Ｘｉａｏ—ｘｉａｏ　，ＨＡ　Ｚｈｕｏ　，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇ￣ｉｅ　，Ｌ１Ｕ　Ｈｕｉ—ｌｉ　’　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１　１０６，Ｃｈｉｎａ；２　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｍｕｎｃｉｃｐａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１　１０６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ（ＳＩＶ）ｉｎ　ｐｉｇｓ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　４０一ｄａｙ－ｏｌｄ　ｐｉｇｓ　ｗｉｔｈ　Ａ／Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７　ＳＩＶ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｐｉｇｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｙｍｐｔｏｍ　ｏｆ　ｃｏｕｇｈ　ａｎｄ　ｓｎｅｅｚｉｎｇ，ａｎｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ　ｎａｓａｌ　ｓｗａｂｓ，ａｎａｌ　ｓｗａｂｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ａｔ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ（ＤＰＩ）ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　Ｓ１Ｖ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｎａｓａｌ　ｓｗａｂｓ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｆｏｒ　８　ｄａｙｓ；Ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｍｕｃｕｓ　ｆｒｏｍ　３　ＤＰＩ　ｔｏ　１　０　ＤＰＩ，ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌ　ｓｗａｂｓ　ｆｒｏｍ　２　ＤＰＩ　ｔｏ　８　ＤＰＩ，ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｔｅｓ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ　ｗａｓ　５　ＤＰＩ　ｔｏ　７　ＤＰＩ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ａ／Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７　ｖｉｒｅｓ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｍｕｃｏｕｓ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｐｏｒｔ　ｏｆ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ＷＯｒｄｓ：ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｕｓ；ｒｅａｌｒ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ；ｖｉｒｕｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　猪流感（Ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ｓｉ）是由ｓＩ病毒（ＳＩＶ）Ｉ　龄、品系的猪均可感染发病，对于免疫系统不完善　的仔猪致死率较高。另外，ＳＩＶ还可引起母猪繁殖　起猪的一种急性、高度接触性呼吸道疾病。各年　丰ＣＯｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　收稿日期：２００９—１２—１３　基金项目：上海市农委重点攻关项目（沪农科攻字（２００４）第１２。２号、沪农科攻字（２００９）第５－２号）　作者简介：张鹏超（１９８５－），男，山东莱芜人，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究．　通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｉｌｉｌ＠１６３．ｃｏｍ　第１０期　张鹏超，等．猪流感病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立及应用　７６９　障碍和育肥猪增重减慢等，给养猪业造成较大的危　害。美国是最早报道ｓＩ流行的国家，与西班牙　（１９１８年～１９１９年）人流感大流行同期存在。对流感　１．３．２反转录用ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ试剂提取病毒液　ＲＮＡ用于反转录，２０　Ｌ体系，反应条件为：５０℃　６０　ｍｉｎ．７０℃１５　ｍｉｎ。　病毒遗传学分析表明：Ａ型流感病毒在猪体内能够　发生自然重组，产生新毒株或变异株，还可能获得　直接感染人的能力【　］。所以，对ｓＩ的研究有着更重　１．３．３　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法的建立　采用ＳＹＢＥＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ方法进行ＰＣＲ扩增，扩增条件为：９５℃５　ｓ；　９５℃５　Ｓ、６０℃１０　Ｓ、７２℃１５　Ｓ，４０个循环；７２℃　要的公共卫生学意义。　我国ＳＩＶ流行和分布比较复杂，既有传统的　Ｈ３Ｎ２和ＨＩＮ１亚型，也有类禽Ｈ１Ｎ１、重组Ｈ１Ｎ２　亚型株。本实验室分离到一株Ａ／ＳＷ／ＳＨ／１／２００７　（Ｈ１Ｎ２）ｆＳｗ／ＳＨ／１／２００７）病毒【３Ｊ，含有来源于猪、人和　禽的３源基因。为了解该病毒的致病特性及组织嗜　性，本研究建立了检测ＳＩＶ核酸的荧光定量ＰＣＲ　（Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）方法，并对Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７感染仔猪　后体内病毒分布情况进行研究。　１　材料和方法　１．１　病毒株、质粒和实验动物　ＳＩＶ（Ｓｗ／ＳＨ／　１／２００７）由本实验室分离、鉴定并保存　；猪瘟病毒　（ＣＳＦＶ）和猪蓝耳病病毒（ＰＲＲＳＶ）核酸由本研究所有　关课题组提供；Ａ／ＳＷ／ＳＨ／１／２００７病毒ＮＰ基因重组　质粒由本实验室构建并保存；ＳＰＦ鸡种蛋购自山东　吴泰实验动物繁育有限公司，孵化至９日龄～１０日　龄，用于病毒增殖；ＳＩＶ血清抗体阴性的４０日龄上　海白猪购自上海某养殖场；ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ　３０００型　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪器为ＣｏｒｂｅＲ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司产品。　１．２　主要试剂ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　１　ｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ总ＲＮＡ提取试剂、ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　试剂ＳＹＢＥＲ　Ｐｒｅｍｉｘ和Ｅｘ　Ｔａｑ均购自ＴａＫａＲａ公司；　反转录引物１２　Ｕ　ｐｒｉｍｅｒ［　１和ＰＣＲ扩增引物均由上海　生工生物工程服务有限公司合成。　１．３荧光定量ＰＣＲ方法的建立　１－３．１　引物设计参考ＧｅｎＢａｎｋ中登录的Ｈ１Ｎ２亚　型ＳＩＶ核蛋白ＮＰ基因序列，用Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（Ｖ７．１１进　行同源性分析，筛选ＮＰ基因保守区，应用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ软件设计两对近５’区域的引物：ＮＰ。１一Ｆ：　５＇－ＧＡＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣ．３’和ＮＰ．１．Ｒ：　５＇－ＣＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＧＡＣ一３’，扩增片段大小　为１　１　１　ｂｐ；ＮＰ一２一Ｆ：５　ｖ＿ＧｃｃＡｃＡＴＡＴｃＡＧＡＧＡＡｃＡＡ　ＧＡＧＣ．３’和ＮＰ一２一Ｒ：　５＇－ＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣ　ＡＣ．３’，扩增片段大小为１２３　ｂｐ。　～９５℃绘制熔解曲线。　１．３．４标准曲线绘制及结果判定测定ＮＰ重组质　粒的浓度和纯度，梯度稀释后，绘制ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　检测方法标准曲线。荧光强度增加值为阴性对照的　２倍～３倍及循环阈值（Ｃｔ值）≤０判定为阳性，反之　判定为阴性。通过熔解曲线进一步判断是否含有非　特异性扩增。　１．３．５特异性和灵敏性检测　分别选择重组质粒、　病毒ｃＤＮＡ、健康猪组织ｃＤＮＡ、ＣＳＦＶ和ＰＲＲＳＶ　核酸为模板进行ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ扩增，检测方法的特　异性，同时回收扩增的ＤＮＡ片段进行测序，验证　扩增特异性。将质粒无限倍比稀释，直至显示无扩　增曲线，判断检测的灵敏度。以倍比稀释病毒核酸　作为模板进行扩增，确定最低检测限量。　１．４细胞半数病变（ＴＣＩＤｓｏ）测定　根据文献［５］方法　测定病毒ＴＣＩＤ　，并按照Ｒｅｅｄ—Ｍｕｎｃｈ法计算ＳＩＶ病　毒的ＴＣＩＤ５０。　１．５　ＳｌＶ人工感染猪试验将１２头４０日龄仔猪随　机分组，试验组９头，对照组３头。１．８４　Ｘ　１０　ＴＣＩＤ蜘　剂量的病毒鸡胚尿囊液滴鼻接种实验猪，每头１　ｍＬ，　对照组接种相同体积的生理盐水。　感染后每天采集试验组和对照组猪的鼻拭子和　肛门拭子样品，置于１　ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液中；同时分　别于感染后第３　ｄ、第５　ｄ、第７　ｄ、第１０　ｄ、第１２　ｄ　和第２８　ｄ各迫杀一头猪，采集其脑、肺脏、喉头、　气管、支气管、肺部淋巴结、扁桃体、肝脏、脾脏　和肾脏等组织的样品，于．８０℃冻存，用作病毒核　酸检测。　同时采用血凝抑制试验检测感染猪血清抗　Ｓｗ／ＳＨ／Ｉ／２００７抗体，以验证试验特异性。　１．６样品中病毒的检测　组织样品经冰浴研磨，提　取ＲＮＡ。拭子样品经漩涡震荡，取上清提取总　ＲＮＡ。采用建立的ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法检测ＳＩＶ核　酸。回收ＤＮＡ片段，测序验证扩增片段特异性。　７７０　中国预防兽医学报　２０１０芷　２　结　果　２．１　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法的建立　品检测显示，ＳＩＶ主要分布于呼吸系统，尤其是肺　脏中，其最高ｃｔ值可达７．２５。其它内脏如脾脏、淋　巴结和脑组织中含量较少，ｃｔ值接近３０。１２　ｄ后各　组织器官均未检测到ＳＩＶ（表２）。迫杀猪血清抗体　的检测显示，针对Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７病毒的血凝抑制抗　体效价为２５以上，表明仔猪为ＳＩＶ特异性感染。　Ｍ　ｌ　２　３　４　２．１．１　引物的选择及ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法的建立　以　ＮＰ重组质粒为模板，分别用２对引物进行扩增，均　有良好的反应性能。由于ＮＰ—１　Ｆ／ＮＰ一１－Ｒ引物对更　接近ｃＤＮＡ　５’端保守区，凶此，选择ＮＰ　１引物对进　行ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法的建立。优化ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反　应条件时，当引物浓度为０．４　Ｍ和０．５　Ｍ时，随　着循环次数的增加，出现一定非特异性扩增。而引　物浓度为０．２　Ｍ时，扩增曲线圆滑，循环４０次以　上未见非特异性扩增，【大Ｊ此，选用０．２　Ｍ作为　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测最佳引物浓度。　２　０００　ｂｐ　１　０００　ｂｐ　７５０　ｂｐ　５００　ｂｐ　ｉ自　；ｉ　　ｌ蚺鞲■■　２５０　ｂｐ　ｌ　ｌ１００　ｂｐ　＿■＿　　ｌ２．１．２特异性试验分别选择重组质粒、病毒ｃＤＮＡ　Ｍ：ＤＬ２０００　ＤＮＡ分子量标准；１：阴性对照；　２：ＮＰ阳性重组质粒；３：ＳＩＶ核酸；４：健康猪组织样品ＲＮＡ　Ｍ：ＤＬ２０００　Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；２：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ；　３：ＳＩＶ；４：Ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｈｅａｌｔｈ　ｐｉｇ　和健康猪组织ｃＤＮＡ进行ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ扩增，循环　４０次，阳性重组质粒和病毒ｃＤＮＡ均呈现特异性扩　增，而对健康猪组织样品扩增为阴性（图ｌ、图２）。　同时，以ＰＲＶ和ＰＲＲＳＶ核酸为模板，扩增结果为　阴性。将目的片段回收，测序证实为ＳＩＶ　ＮＰ基因　序列，表明为特异性扩增。　２．１．３灵敏度试验将重组质粒系列倍比稀释，当　重组质粒浓度在３．６２　Ｘ　１０。。ｉｘｇ／ｍＬ￣３．６２　Ｘ　１０　ｐ．ｇ／ｍＬ　时，扩增呈现良好的线性关系，重组质粒浓度高于　３．６２　Ｘ　１０。。ｐ￣ｇ／ｍＬ，在３０个循环内可见扩增曲线但　模板浓度与ｃｔ值无显著的线性关系；Ｃｔ值≤３０，　重组质粒检测最低限量为３．６２　Ｘ　０”Ｉｘｇ／ｍＬ（图３）。　２．１．４标准曲线的绘制将阳性重组质粒倍比稀释　ｍＬ，每浓度设３　Ｃｙｃｌｅ　Ｎｕｍｂｅｒ　至３．６２×１０～ｐ，ｇ／ｍＬ￣３。６２　Ｘ　ｌ０　ｌ：ＳＩＶ核酸；２：ＮＰ重组质粒；３：阴性对照；　４：健康猪组织ｃＤＮＡ　ｌ：ＳＩＶ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ；２：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮＰ　ｐｌａｓｍｉｄ；３：Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ　４：ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｈｅａｌｔｈ　ｐｉｇ　个重复，进行标准曲线的绘制（图４）。Ｃｏｎｃ（￣ｇ／ｍＬ）　＝１０　ｒ－０．２９６　Ｘ　Ｃｔ＋１．１５ｏ）　２．２　病毒ＴＣＩＤ∞及最低检出限量的测定采用　图２　ＮＰ一１引物对ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ扩增结果　Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ＳＩＶ　ｂｙ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｒｅｅｄ．Ｍｕｎｃｈ法汁算病毒的ＴＣＩＤ￣／ｍＬ为１．８４×１０　。　实验猪接种病毒量为１．８４×ｌ０　ＴＣＩＤ∞，１　ｍＬ／头。　根据标准曲线的ｃｔ值与检测样品浓度公式，　ＳＩＶ核酸样品ｌ０倍倍比稀释至１０。时，检测结果为　阳性，１０　以上稀释度检测均为阴性。汁算ＳＩＶ核　酸检测最低浓度为３０　ＴＣＩＤ∞（图５）。　２．３人工感染猪的临床症状实验猪接种病毒后第　２　ｄ，仔猪出现轻微流感症状，活动减少；其中两头　较弱小的仔猪出现咳嗽、打喷嚏症状。一周后症状　减轻或基本消失，２周内仔猪恢复正常。　２．４感染猪组织器官ＳＩＶ分布对实验猪组织样　Ｆｉｇ．３　ＡｍＣｙｃｌｅ　图３　阳性重组质粒无限稀释后检测结果　ｐｌｉｉｃａｔｆｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｓｉｉｔｖｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ、Ⅳｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　第１０期　张鹏超，等．猪流感病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立及应用　７７１　２２　２Ｏ　ｌ８　ｌ６　１４　１２　ｌＯ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　图４以重组质粒为模板绘制扩增标准曲线　ｉＦｇ．４　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｇｌｌｒｖｅ　ｏｆｐｌａｓｍｉｄ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｃｙｃｌｅ　图５　Ｓ１Ｖ核酸检测灵敏度结果　Ｆｉｇ．５　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＳＩＶ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ　表２组织样品中病毒核酸的检测　Ｔａｂｌｅ　２　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｓ　组织样品　采样时间Ｄａｙｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｔｉｓｓｕｅｓ　３　ｄ　５　ｄ　７　ｄ　１０　ｄ　１２　ｄ　２８　ｄ　Ｎｏｔｅ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ（＋）；Ｎｅｇｉｔｉｖｅ（一）　２．５粘膜局部ＳＩＶ核酸检测感染猪鼻试子样品　检测显示，感染后１　ｄ～９　ｄ为ＳＩＶ阳性，１０　ｄ后检　测均为阴性。肛门拭子样品检测显示，感染后２　ｄ　～８　ｄ为阳性，第９　ｄ以后检测为阴性，表明ＳＩＶ感　染后在口鼻黏膜存在９　ｄ，而感染后第２　ｄ～８　ｄ通　过粪便排毒。　３讨　论　Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法特异性强，灵敏度高，是目　前分子检测方法中操作相对简便、准确性高的实用　技术，尤其适合样品含量较低时使用。最近的一项　研究报道，ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ最低可检测含１　ＴＣＩＤ卯的　犬瘟热病毒样本【６１。由于ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应和分析　在完全闭管的条件下进行，能够有效防止ＰＣＲ产物　的污染，提高检测结果的可靠性。本研究建立并优　化了ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法，为ＳＩＶ检测提供灵　敏，准确的方法。　近年来，我国ＳＩＶ分布和流行较为复杂，不仅　有传统的Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型，还出现了类禽Ｈ１Ｎ１　及含有猪、人、禽源基因的重组Ｈ１Ｎ２病毒，给　Ｓ１Ｖ防控造成极大困难［７＿８】。２００７年本实验室分离得　到一株重组Ｈ１Ｎ２病毒　ｓｗ／ｓＨ／１／２００７（Ｈ１Ｎ２）［３１，　为了解该病毒在猪体内分布情况，分析其致病性和　生物学特性，本研究将病毒经鼻粘膜途径感染仔　猪，并采用建立的ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法对病毒在感染　猪脏器内的分布进行了研究。结果显示，部分感染　猪出现了典型的ｓＩ症状，接种病毒后第２　ｄ即有仔　猪出现食欲下降、活动减少等症状，而后弱小仔猪　出现咳嗽、打喷嚏等症状，两周内症状消失，恢复　正常，对照组猪无临床症状。血清抗体检测人工感　染前猪抗Ａ／ＳＷ／ＳＨ／１／２００７（Ｈ１Ｎ２）血清抗体为阴性，　感染后均产生针对Ａ／ｓ、ｖ／ｓＨ／１／２ｏ０７（Ｈ１Ｎ２）的特异性　血凝抑制抗体，表明为特异性感染。病毒滴鼻感染　后第３　ｄ可从气管、喉、肺脏等上呼吸道组织中检　测到病毒核酸，而且病毒含量较高。脾脏在感染后　第５　ｄ检测到病毒，并持续至第７　ｄ，病毒含量低于　肺脏。值得注意的是，在感染后第５　ｄ迫杀的猪脑　内检测到病毒核酸，而其它猪均未在脑组织中检测　到。表明呼吸道系统是Ａ／ＳＷ／ＳＨ／１／２００７定殖的主要　场所，而脾脏、淋巴结则存在少量病毒。　病毒感染后，鼻腔黏膜、肛门试子均可连续检　测到病毒。鼻腔黏膜中病毒检测持续到感染后第　９　ｄ，肛试子样品感染后第８　ｄ仍可检测到病毒核　酸，表明猪体可以通过鼻腔分泌物以及粪便向环境　中排毒，排毒周期在一周以上。表明猪在感染ＳＩＶ　后的一周内是传染源。　有研究报道人流感病毒接种小鼠后，３０　ｍｉｎ即　可在小鼠各脏器中检测到病毒，３　ｈ后除脑组织外　其它器官亦可检出Ｉ９ｊ。Ｖｉｎｃｅｎｔ等应用细胞分离病毒　的方法，检测Ｈ３Ｎ２亚型ＳＩＶ感染仔猪情况，结果　显示鼻拭子中病毒的检出时间可至感染后第７　ｄｉ　ｄＯ］。　７７２　中国预防兽医学报　２０１０钲　许传田等将与Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７遗传相近的ＳＩＶ毒株　Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／２００６感染猪后，用细胞分离病　毒方法检测显示，鼻棉拭子中病毒的可分离时间同　样仅持续一周左右…］。Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７感染仔猪后病　毒检出持续时间为９　ｄ，这可能与病毒粒子特性和　检测方法有关。　本研究初步探讨了分离株Ｓｗ／ＳＨ／１／２００７人工感　染仔猪后猪体内病毒分布规律，表明呼吸系统为病　毒主要定殖场所，并可通过呼吸道黏膜、粪便途径　向体外排毒，本研究为深入了解ＳＩＶ组织嗜性及致　病机理奠定了基础。　参考文献　伍锐，金梅林，陈焕春，等．猪流感病毒研究进展Ⅲ．动物　医学进展，２００４，２５（１）：２５—２８．　［２］　蒙雪琼，刘棋，陈义祥，等．基因重排ＨＩＮ２亚型猪流感病　毒的分离鉴定和生物学特性的研究［ＪＪ＿中国预防兽医学报，　２００８，９（３０　：６６９—６７３．　［３］　Ｙｕ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｐ　Ｃ，Ｐａｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌｍｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ—　ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｖｉａｎ—ｌｉｋｅ　Ｈ１Ｎ１　ａｎｄ　ｎｏｖｅｌ　ｅｓｓｏｒｔａｎｔ　Ｈ１Ｎ２　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｇｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍ—　ｍｕｎ，２００９，３８６：２７８—２８３．　［４］　Ｈｏｆｆｍａｎｎ　Ｅ，Ｓｔｅｃｈ　Ｊ，Ｇｕａｎ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ】＿Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，２００１，２２７５—２２８９．　【５］　杜念兴，刘胜江．用微量细胞培养ＥＬＩＳＡ测定ＨＣＬＶ　ＴＣＩＤ　［Ｊ］ｌ畜牧与兽医，２００７，１２（３９）：６８—７０．　［６］　邢明伟，曾祥伟，柴洪亮，等．ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ荧光ＲＴ．ＰＣＲ　法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒【Ｊ】＿中国兽医学报，　２０１０，５：５９７—６０１．　［７］　Ｇｕａｎ　Ｙ，Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ　Ｋ　Ｆ，Ｋｒａｕｓｓ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｖｉａｎ　Ｈ１Ｎ１　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｐｉｇｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，１９９６，７０　（１　１）：８０４１—８０４４．　【８】　蒙雪琼，陈义祥，刘棋，等．Ｈ１Ｎ２亚型猪流感病毒ＨＡ、　ＮＰ、ＮＡ、Ｍ和ＮＳ基因的克隆与序列分析［Ｊ】．畜牧兽医学　报，２００９，４０（２）：２２１—２２７．　［９］　Ｉｓｈｉｄａ　Ｎ，Ｋｏｓａｋａ　Ｙ，Ｓａｓａｋｉ　Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎｆｌｕｅｎ—　ｚａ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ＩＩＩ　Ｅａｒｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ３２　ｌａｂｅｌｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｏｒｇａｎｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ａｆｔｅｒ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｒｏｕｔｅｓ［Ｊ】．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，１９５９，７１：１６３—１７０．　［１０］　Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ａ　Ｌ，Ｓｗｅｎｓｏｎ　Ｓ　Ｌ，Ｌａｇｅｒ　Ｋ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｅ—　ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｃｏｕｎｔｙ　ｆａｉｒ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｉｇ　Ｖｅｔ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｃｏｎｇ　Ｐｒｏｃｅｅ，２００８．　许传田，樊树芳，杨焕良，等．Ｈ１Ｎ２亚型猪流感病毒　Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／ｌ／０６分离鉴定和对猪致病性研究…．中　国预防兽医学报，２００９，３１（１）：４６—５Ｏ．　（本文编辑：杨朋欣、张朝霞）