VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

安徽医药Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１３　Ｊａｎ；１７（１）　・４５・　ＶＥＧＦＡ基因重组真核表达载体的构建与表达　吴勇　，刘学刚　，郭嘉诚　，李慧敏　，丁周志　，王亚明　，宋伟。，徐家丽　，赵武　（蚌埠医学院第一附属医院１．儿科；２．心胸外科；３．超声心动图，安徽蚌埠２３３００４）　摘要：目的构建ＶＥＧＦＡ基因重组真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ，并检测其在人胚胎肾细胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）中的表达。方法以人　脐血单核细胞的ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ—ＰＣＲ技术扩增ＶＥＧＦＡ基因，并将其定向插入真核表达载体ｐＥＧＦＰ．Ｎ１中，构建重组真核　表达载体ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ。经性核酸内切酶ＢｇｌＩＩ和ＳａｌＩ酶切和ＤＮＡ测序鉴定后，用脂质体法将ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ转染　ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，转染后２４　ｈ和４８　ｈ采用荧光显微镜观察ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ的表达。结果ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ被双酶切为４　６９７　ｂｐ　和１　２５１　ｂｐ两条条带，测序结果证实ＶＥＧＦＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＶＥＧＦＡ　ｍＲＮＡ序列完全一致。在经转染的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞　内观察到较强的绿色荧光，表明ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ成功转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，并在其中得到了表达。结论成功构建重组真核表　达载体ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ，为进一步研究ＶＥＧＦＡ基因的生物学功能奠定了基础。　关键词：血管内皮生长因子Ａ；基因；遗传载体　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＶＥＧＦＡ　ｇｅｎｅ　Ｗｕ　Ｙｏｎｇ　。ＬＩＵ　Ｘｕｅ．ｇａｎｇ　。ＧＵＯ　Ｊｉａ—ｃｈｅｎｇ　，ｅｔ　ａｌ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ１．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ；２．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＢｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ　２３３００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＧＦＰ－ＶＥＧＦＡ，ａｎｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＶＥＧＦＡ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＧＦＰ・—Ｎ１　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＧ－・　ＦＰ—ＶＥＧＦＡ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＧＦＰ－ＶＥＧＦＡ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＢｇｌＩＩ　ａｎｄ　Ｓａｉｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ　ｗａｓ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ＨＥＫ２９３Ｔ　ｃｅｌｌ　ｂｙ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ　ｒｅａｇｅｎｔ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａｔ　２４　ａｎｄ　４８　ｈ　ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｌｌｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ　ｗａｓ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　４　６９７　ａｎｄ　１　２５　１　ｂｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＶＥＧＦＡ　ｉｎ　ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ＧｅｎＢａｎｋ　ＶＥＧ－　ＦＡ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ００１０２５３６６．Ｓｔｒｏｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＨＥＫ２９３Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐＥＧＦＰ－ＶＥＧ－　＿ＦＡ，ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ＨＥＫ２９３Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｏｎｄｕ－　ｓｉｏｎ　Ｗｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｖ　ｃｏｎｓｔｕｃｔｒ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔ０ｒ　ｐＥＧＦＰ．ＶＥＧＦＡ，ｗｈｉｃｈ　ｌａｙｓ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＶＥＧＦＡ　ｇｅｎｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ａ；ｇｅｎｅ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒｓ　基金项目：安徽省自然科学基金面上项目（Ｎｏ　１１０４０６０６Ｍ１９８）　作者简介：吴勇，男，硕士研究生　通信作者：赵武，男，博士，副教授，研究方向：ｄ，ＪＬ血管疾病的临床与基础研究，Ｅ・ｍａｉｌ：ｚｈａｏｗｕｒｏｎｇｈａｉ＠ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ．ｃｎ　［１］　Ｎａｚｉｋ　Ｈ，０ｎｇｅｎ　Ｂ，Ｅｒｔｕｒａｎ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｓｃｅｐ—　ｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｐｓｅｕｄｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ａｎｄ　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌ—　趣，目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构　分析、ＤＮＡ指纹分析和基因定位等不同研究领域。Ｔａｔｍａｎ—　Ｏｔｋｕｎ曾用这种方法报道过嗜麦芽窄食单胞菌引起的院内小　ｔｏｐｈｉｌｉａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｌ　Ｊ】．Ｊｐｎ　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，　２０ｏ７．６０：８２—８６．　范围暴发感染，本研究检测到在３家医院的嗜麦芽窄食单胞　菌克隆传播流行株，分别是２００６年收集同一医院ＩＣＵ的２　株、２００８年收集同一医院ＩＣＵ的２株及２０１０年收集同一医院　新生儿科的２株，２００８年ＩＣＵ的菌株来源于痰标本，其它两　个科室的菌株来源于血标本。我们收集的只是每年９月份的　标本，其造成的院内流行爆发情况尚不清楚，如果能应用这种　简便、快速的ＲＡＰＤ—ＰＣＲ方法检测调查院内嗜麦芽窄食单胞　菌感染流行情况，就可及时发现临床流行株的爆发，追踪相应　的感染源并指导临床加强对病房特殊部位如心电监护仪、微　量输液泵、床栏杆、门把手等的清洁和消毒措施。因此，应用　ＲＡＰＤ．ＰＣＲ方法对临床分离菌株进行基因分型和同源性的快　速检测，调查感染流行情况对阻止暴发感染进一步扩大具有　重要的临床指导意义。　参考文献：　［２］　胡立芬，叶英，沈为华，等．嗜麦芽窄食单胞菌的天然及获得性耐　药机制研究进展［Ｊ］．中国抗生素杂志，２０１１，３６（９）：６５４—６５８．　［３］　Ｃｒｏｓｓｍａｎ　ＬＣ，Ｇｏｕｌｄ　ＶＣ，Ｄｏｗ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ，ｃｏｍ—　ｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｌｌａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｔｅｎｏｔｍｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ｒｅ．　ｖｅａｌｓ　ｎ　ｏｒｇａａｎｉｓｍ　ｈｅａｖｉｌｙ　ｓｈｉｅｌｄｅｄ　ｂｙ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔｎｃｅ　ｄｅｔａｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｌ　Ｊ　ｆ．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌ，２ｏ０８，１７：Ｒ７４．　［４］Ｌｉｎ　ＣＷ，Ｈｕａｎｇ　Ｙｗ，Ｈｕ　ＲＭ．ｒＩ１ｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＡｍｐＲ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ１　ｎｄ　Ｌ２　ｂｅｔａａ．１ａｃｔａｍａｓｅｓ　ｉｎ　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ｌ　Ｊ　ｊ．Ｒｅｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．２０ｏ８．２８：１２６—１３６．　『５　１　Ｍａｒｉａ　ＢＳ，Ｍａｒｔｆｎｅｚ　ＪＬ．ＳｍＱｎｒ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔｏ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ　ｉｎ　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ｌ　Ｊ　１．Ａｎｔｉｍｉｅｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１０．１９：５８０—５８１．　『６　１　Ｓａｎｃｈｅｚ　ＭＢ，Ｈｅｍａｎｄｅｚ　Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒｎｓｍｉａｓｓｉｂｌｅ　ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａ—　ｈｏｐｈｉｌｉａ　ａｓ　ａ　ｐｏｔｅｎｔｉｌ　ｓｏｕｒａｃｅ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｑｎｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　｛Ｊ　１．ＢＭＣ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８：１４８—１６２．　ｆ７］Ｌｉａｗ　ＳＪ，Ｌｅｅ　ＹＬ，Ｈｓｕｅｈ　ＰＲ．Ｍｕｈｉｄｒｕｇ　ｅｓｉｒｓｔｎｃｅ　ｉａｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ：ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒｏｎｓ，ｅｆｌｆｕｘ　ｐｕｍｐｓ，　ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ（ＳｐｇＭ），ａｎｄ　ｍｅｌｎｉａｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆ　Ｊ　１．Ｉｎｔ　Ｊ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ，２０１Ｏ，３５：１２６—１３０．　（收稿日期：２０１２—０７—１７，修回日期：２０１２一Ｏ８—１０）　・４６・　安徽医药Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１３　Ｊａｎ；１７（１）　左室流出道梗阻（Ｌｅｔｆ　Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　Ｏｕｔｆｌｏｗ　Ｔｒａｃｔ　Ｏｂｓｔｒｕｃ—　１６℃连接反应２　ｈ。连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细菌，转化　ｔｉｏｎ，ＬＶＯＴＯ）是一类常见的先天性心脏病，占先天性心脏病　的菌液涂布于含卡那霉素（５０　ｍｇ・Ｌ　）的ＬＢ固体琼脂培养　发病总数的１４％，遗传率高达０．７１—０．９０　。Ｚｈａｏ等　于　基上，３７￣Ｃ倒置过夜。挑取单个菌落接种含卡那霉素（５０　ｍｇ　２０１０年首次报道血管内皮生长因子Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　・Ｌ　）的ＬＢ液体培养基，３７％、２００　ｒ・ｍｉｎ　摇菌过夜，提取　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ，ＶＥＧＦＡ）基因突变可能与ＬＶＯＴＯ发生有关，　重组质粒ＤＮＡ。　为ＬＶＯＴＯ可能是寡基因遗传的假设提供了证据。本研究旨　１．２．５　ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ的鉴定提取重组质粒后用性核　在构建ＶＥＧＦＡ基因重组真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ，并在　酸内切酶ＢｇｌＩＩ和ＳａｌＩ对ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ进行酶切鉴定。将　真核系统中表达，为进一步研究ＶＥＧＦＡ突变体的生物学功　酶切鉴定阳性的重组载体分别送上海英潍捷基生物技术有限　能奠定基础。　公司和上海捷瑞生物工程有限公司测序。　１材料与方法　１．２．６　ｐＥＧＦＰ．ＶＥＧＦＡ转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞将含有目的质　１．１材料人脐血来源于蚌埠医学院第一附属医院妇产科，　粒的细菌接种于含卡那霉素（５０　ｍｇ・Ｌ　）的１００　ｍＬ　ＬＢ液体　均征得产妇同意，并签署知情同意书。克隆宿主大肠杆菌　培养基中，３７％、２００　ｒ・ｍｉｎ　摇菌过夜，无内毒素质粒大提试　ＤＨ５ａ、质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１均由蚌埠医院临床检验诊断学实验中　剂盒提取质粒。复苏冻存于液氮中的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，将其培　心提供；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提取试剂盒、无内毒　养于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ中。置３７￣Ｃ、５％ＣＯ：恒温培　素质粒大提试剂盒购白天根生化科技（北京）有限公司；Ｒｅ—　养箱中培养，当ＨＥＫ２９３Ｔ细胞处于对数生长期时，细胞胰酶　ｖｅｒＴｒａ—Ｐｌｕｓ（高保真ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒）、性核酸内切酶Ｂｇ—　消化计数（密度为５×１０　个／Ｌ），取２　ｍＬ接种于６孔培养板　ｌＩＩ和ＳａｌＩ购自ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ［东洋纺（上海）生物科技有限公　中，置３７℃、５％ＣＯ　培养箱中培养，２４　ｈ后细胞融合生长至　司］；Ｔ４　ＤＮＡ连接酶及ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ购自宝生物工程（大连）有　９０％～９５％，分别将４　ｇ重组质粒ｐＥＧＦＰ—ＶＥＧＦＡ和８　Ｌ脂　限公司；ＴＲＩｚｏｌ总ＲＮＡ抽提试剂、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００、Ｏｐｔｉ—　质体溶于２５０　ＯＰＴＩ—ＭＥＭ培养基中，轻混匀，５　ｍｉｎ后将两　ＭＥＭ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；无支原体胎牛血清　者混合，置室温孵育２０　ｍｉｎ，制备复合物。将复合物按每孔　（ＦＢＳ）购自浙江天杭生物科技有限公司；胰酶购于江苏碧云　５００　ＦｘＬ加入到６孑Ｌ板中，于３７％、５％ｔＣＯ２培养６　ｈ，然后更换　天公司；高糖ＤＭＥＭ培养基购于美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。　含１０％胎牛血清的新鲜培养基ＤＭＥＭ　２　ｍＬ继续培养。转染　１．２方法　后２４～４８　ｈ后通过荧光显微镜直接观察瞬时转染情况，实验　１．２．１总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ制备收集脐血，红细胞裂解　中同时设置未转染组作为对照。　法提取单核细胞，参照ＴＲＩｚｏｌ总ＲＮＡ抽提试剂盒说明书提取　２结果　．　细胞总ＲＮＡ，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。采用　２．１　ＶＥＧＦＡ基因扩增结果ＶＥＧＦＡ引物中引入酶切位点　ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ公司ＲｅｖｅｒＴｒａ—Ｐｌｕｓ逆转录试剂盒操作方法制备　和保护性碱基，去除终止密码，整个扩增基因片断长度为１　ｃＤＮＡ。　２５８　ｂｐ，ＲＴ—ＰＣＲ产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳分离后，得到一　１．２．２聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＶＥＧＦＡ基因　根据Ｇｅｎ—　条约１　２５８　ｂｐ的条带，与预期ＶＥＧＦＡ基因片段大小一致（图　Ｂａｎｋ公布的ＶＥＧＦＡ　ｍＲＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１０２５３６６），　１）。　采用在线Ｐｒｉｍｅｒ３引物设计软件设计引物（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．　２．２重组载体ｐＥＧＦＰ－ＶＥＧＦＡ酶切鉴定　重组载体ｐＥＧ—　ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ—ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ），分别在５’端和３’端加　ＦＰ－ＶＥＧＦＡ经ＢｇｌＩＩ以及ＳａｌＩ双酶切，１．２％琼脂糖凝胶电泳　上性核酸内切酶ＢｇｌｌＩ以及ＳａｌＩ的酶切位点和保护碱基，　显示同一泳道出现约４　６９７　ｂｐ和约ｌ　２５１　ｂｐ的两条条带，与　并保持ＶＥＧＦＡ阅读框正确，引物由上海英潍捷基生物技术　预期结果相符（图２）。　有限公司合成，序列如下：上游引物Ｐ１：５’一ｇｇａａｇａｔｃｔｃＣＴ—　Ｍ　ＧＡＣＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣ－３’（下划线为ＢｇｌＩＩ酶切位　点）；下游引物Ｐ２：５’－ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔｇＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＦＧＴＣＡＣＡＴ．　Ｍ　２０００　３’（下划线为ＳａｌＩ酶切位点）。ＰＣＲ反应体系：ｃＤＮＡ　１　ＩｘＬ，　Ｐ１（１０　ｍｍｏｌ・Ｌ　）０．７５　ｉｘＬ，Ｐ２（１０　ｍｍｏｌ・ＬＩ１）０．７５　ｔｘＬ，１０　１０００　×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５　ｔｒＬ，２５　ｍＭ　ＭｇＳＯ４　１．５　Ｌ，１０　ｍＭ　ｄＮＴＰ０．５　７５０　ＩｘＬ，ＫＯＤ—Ｐｌｕｓ　０．５　Ｌ，灭菌蒸馏水１７．５　ＩｘＬ。反应条件：预变　５００　性９４ｏＣ２　ｍｉｎ，变性９８℃１０　Ｓ，复性５６．５℃３０　Ｓ，延伸６８￣Ｃ　９０　Ｓ，共３５个循环。ＰＣＲ扩增产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳检测　后，用普通琼脂糖凝胶回收试制盒回收目的基因。　２５０　１．２．３质粒ｐＥＧＦＰ—ＮＩ的制备将含有质粒ｐＥＧＦＰ．ＮＩ的大　肠杆菌接种于含卡那霉素（５０　ｍｇ・Ｌ　）的ＬＢ固体琼脂培养　１ＯＯ　基中，培养过夜后，挑取一个单菌落接种到５　ｍＬ含卡那霉索　（５０　ｍｇ－Ｌ　）的ＬＢ液体培养基中，３７￣Ｃ、２００　ｒ・ｍｉｎ　摇菌　过夜，收集菌液，用质粒提取试剂盒提取质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１。　］［　１　Ｖ　ＥＧ　ＦＡ￣［］　ＲＴ－图２　………１．２．４　ＶＥＧＦＡ基因重组真核表达载体ｐＥＧＦＰ．ＶＥＧＦＡ的构　。．　结果　。　注结果　、、　：建用ＢｇｌＩＩ和ＳａｌＩ酶切扩增的ＶＥＧＦＡ基因及载体ｐＥＧＦＰ．　：ＤＮＡ　００。ｍａｒｋｅｒ；　Ｂ　ＩＩ　‘ＳＭ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１　：　ａｌ‘Ｉ双酶切重组载体　ＳＯ００．　ＰｃＲ产物。。Ｎ１，凝胶电泳分离，回收目的基因，用Ｔ４　ＤＮＡ连接酶连接，　１．　。　ＧＦ＿　：ｖＥＧ　：……　…